材料和试剂

移液器吸头（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific TM Basix TM 通用提示）
Fisherbrand无菌100 x 15 mm聚苯乙烯培养皿（Fisher Scientific，目录号：FB0875713）
1 ml注射器（BD，目录号：302100）
50ml Falcon管（Corning，Falcon ®，目录号：352070）
根癌土壤杆菌（GV3101）
本土烟草（Nicotiana benthamiana）（ N。本哈米纳）植物; 2-4周龄（6-10叶阶段）
用于RNA，RNA结合蛋白（RNA-BP）和MCP的门户入口克隆
TriFC网关目标向量（pBA3130,3132,3134,33136，pBA-GW-MS2和pBA-MS2-GW）
LR克隆酶II（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：11791100）
LB中等粉末（MP Biomedicals，目录号：113002082）
壮观霉素（1,000x; 100mg / ml）（Sigma-Aldrich，目录号：S4014）
庆大霉素（1,000x; 50mg / ml）（Sigma-Aldrich，目录号：G1264）
卡那霉素（1,000x; 100mg / ml）（Sigma-Aldrich，目录号：K0200000）
Bacto琼脂（BD，Bacto TM ，目录号：214010）
乙醇或DMSO
MES（Sigma-Aldrich，目录号：M8250）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
Acetosyringone（Sigma-Aldrich，目录号：D134406）
LB媒体（见食谱）
LB琼脂培养基（见食谱）
100mM乙酰丁香酮（见配方）
LB-MES（pH 5.6）（参见食谱）
再悬浮液（参见食谱）

设备

PIPETMAN Classic TM 移液器（Gilson，型号：P1000，P100，P20，目录号：F123602，F123615，F123600）
离心机用于50ml管（Beckman Coulter，型号：Avanti J-20XP）
光谱仪（Biochrom，型号：Ultrospec 2100 pro）
共焦激光扫描显微镜（ZEISS，型号：LSM 780）
高压釜（TOMY DIGITAL BIOLOGY，型号：ES-215）
层流柜（NuAire，型号：NU-440-400E）
孵化器（MMM Medcenter Einrichtungen，型号：INCUCELL 55）
振动孵化器（Infors，型号：Multitron Standard）

软件

ZEN（ZEISS共焦显微镜图像分析程序）

程序

按照制造商的说明，通过LR反应（Gateway）与您的进入克隆（RNA，RNA-BP和MCP）构建TriFC载体;具有Gateway BiFC载体（pBA3130,33132,3134和3136;图1A和1B）（Seo等人，2017）的LR反应MCP和RNA-BP进入克隆。具有Gateway MS2标记载体（pBA-6xMS2-GW或pBA-GW-6xMS2;图1C）的LR反应RNA进入克隆（Schonberger等人，2012）。在本研究中，我们使用pENTR-ELENA1进行RNA进入克隆，pENTR-MED19a用于RNA-BP进入克隆，pENTR-MCP用于MCP进入克隆。

图1. TriFC系统载体的示意图。 A.与YFP片段融合的RNA结合蛋白的表达载体示意图; B.与YFP片段融合的MCP的表达载体示意图; MS2标记的RNA表达载体示意图; D.用于RNA-蛋白质相互作用的TriFC系统的图示
通过加热使每个DNA构建体（50ng）（3种不同载体;图1A，1B和1C）转化50μl感受态细胞（10μg/ ml cfu / ml）休克方法（Höfgenand Willmitzer，1988）
将细胞扩散到LB /壮观霉素琼脂培养基上（参见食谱），并在28-30℃的培养箱中培养2天。
在适当的抗生素的5ml LB中接种一个单一的土壤杆菌菌落（参见食谱）。在振荡的培养箱中，在28-30℃下以200rpm的速度生长过夜
使用250微升的过夜培养物接种10ml LB-MES（pH 5.6）（参见食谱）（含相同抗生素）加4μl100mM乙酰丁香酮（参见食谱），并在振荡培养箱中以200rpm在28℃下生长过夜-30°C。
测量过夜培养物的A 600（OD = 0.8-1.0）。
在室温下收集细菌细胞（4,000 x g，10分钟），并将沉淀重新悬浮在再悬浮溶液中（参见食谱）。将最终的A <600> 调整为0.4。
在长时间（室温）下放置超过4小时（或过夜），然后再渗透。
将1ml各种农杆菌细胞悬浮液转移到10ml管中并充分混合（图2A）。
用1 ml注射器进行渗透。简单地按下叶子下面的注射器（无针）（注意：避免子叶。），并用手指在另一侧施加反压力。经常观察到成功的渗透是叶片中“润湿”区域的扩散，并标记渗透区域。（图2B）
在共聚焦激光扫描显微镜观察2-3天后观察YFP信号（图2C）。激发波长为514nm，发射波长的检测范围为520-550nm

图2.NFC中TriFC测定的瞬时表达。本土汉堡。 A.混合三种不同的农杆菌悬浮液。 1携带RNA-BP构建体（图1A），2携带MCP构建体（图1B），3携带MS2标记的RNA构建体（图1C）。 B.用注射器在烟草叶中渗透; C.渗透后2-3天用共焦显微镜观察浸润区域

数据分析

为了避免假阳性信号，我们检查了MED19a和MCP相互作用（图3 [top]）和MED19a，MCP和反义ELENA1组合（图3 [中]）作为阴性对照。我们确认在这些阴性对照中没有YFP信号（我们测试了三个独立的植物）
我们可以在MED19a，MCP和感应ELENA1组合中观察到YFP信号（图3 [底部]）。我们测试了三个独立的植物，并观察了所有植物中的YFP信号
有关ELENA1和MED19a的详细信息，请参见（Seo等人，2017）。

图3. TriFC测定的共聚焦显微镜图像。将nYFP融合到MED19a，将cYFP融合到MCP。与感觉或反义ELENA1融合的6xMS2核苷酸序列。渗透后3天采集共聚焦图像。刻度棒=20μm。

笔记

对于TriFC测定，6xMS2标签，nYFP和cYFP方向的最佳组合有时是至关重要的。因此，如果未检测到信号，则应尝试其他组合。
转录后基因沉默（PTGS）是短暂表达实验中缺乏效率的主要原因（Voinnet等人，2003）。因此，我们通常会共同渗透UBQ：p19，抑制PTGS与其他结构，因为它大大提高了效率。

食谱

LB媒体
具有合适抗生素的LB培养基（用于MS2标记载体的卡那霉素[50μg/ ml]]和部分YFP融合载体的壮观霉素[50μg/ ml] [图1A和1B]）
LB琼脂培养基
具有2％Bacto琼脂的LB培养基和用于部分YFP融合载体的适当抗生素（卡那霉素[50μg/ ml]用于MS2标记载体[图1C]和壮观霉素[50μg/ ml] [图1A和1B]）
100毫克乙酰丁香酮股票
100mM乙酰丁香酮在乙醇或DMSO中储存，储存于-20°C
LB-MES（pH 5.6）
具有10mM MES（pH 5.6）的LB /
重悬液
10mM MgCl 2
10mM MES-KOH（pH5.6）
100μM乙酰丁香酮
注意：在高压灭菌后立即使用之前添加。

致谢

我们感谢Ulrich Z.Hammes博士为Gateway 6xMS2标记向量。这项工作得到了新加坡NRF RSSS授权（NRF-RSSS-002）的支持。

参考

Christensen，N.M.，Oparka，K.J。和Tilsner，J。（2010）。植物中成像RNA的进展趋势植物S ci 15（4）：196-203。
Höfgen，R。和Willmitzer，L。（1988）。存放农杆菌转基因的感受态细胞 Nucleic Acids Res 16（20）：9877.
Schonberger，J.，Hammes，U.Z.and Dresselhaus，T。（2012）。使用λN可植入植物细胞中的RNA， 22系统和候选RNA的GATEWAY兼容载体系列。植物J 71（1）：173-181。
Seo，J.S.，Sun，H.X。，Park，B.S.，Huang，C.H.，Yeh，S.D.，Jung，C.and Chua，N.H。（2017）。 ELF18诱导的长期非编码RNA与介体相关联，以增强先天免疫反应基因的表达>拟南芥。植物细胞 29（5）：1024-1038。
St Laurent，G.，Wahlestedt，C.and Kapranov，P。（2015）。长非编码RNA分类的风景趋势Genet < 31（5）：239-251
Voinnet，O.，Rivas，S.，Mestre，P。和Baulcombe，D。（2003）。基于抑制番茄丛生特技的p19蛋白的基因沉默的植物中的增强的瞬时表达系统病毒。植物J 33（5）：949-956。