材料和试剂

Microtube（INA•OPTIKA，Bio-Bik，目录号：ST-0150F）

多孔培养板6孔（Greiner Bio One International，目录号：657160）

15ml锥形离心管（Greiner Bio One International，目录号：188271）

具有0.22μm孔径膜的注射器过滤器（Pall，目录号：4192）

HEK293T细胞

Notch1表达载体（pTracer-CMV / Notch1 ）（Sawaguchi等人，2017）

注意：不可商业使用。

表达载体（pSecTag2 / Hygro / Eogt）的Eogt表达载体（Sawaguchi等人，2017）

注意：不可商业使用。

GFP表达载体（pMAX-GFP）（Addgene，目录号：VDF-1012）

Dynabeads蛋白A（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：10002D）

Opti-MEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：31985070）

4％多聚甲醛（和光纯药，目录号：163-20145）

胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：172012-500ML）

磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（和光纯药，目录号：196-02835）

磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（和光纯药，目录号：164-04295）

氯化钠（NaCl）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：197-01667）

氯化钾（KCl）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：163-03545）

DLL4-Fc（Thermo Fisher Scientific，目录号：10171H02H）

JAG1-Fc（Thermo Fisher Scientific，目录号：11648H02H）

Dulbecco改良Eagle培养基（NISSUI PHARMACEUTICAL，目录号：05915）

青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）

聚乙烯亚胺，线性，MW 25,000（PEI 25000）（Polysciences，目录号：23966）

胎牛血清（FBS）（见食谱）

磷酸缓冲盐水（PBS）（见食谱）

100ng /μlDLL4-Fc / PBS和100ng /μlJAG1-Fc / PBS（参见食谱）

完成文化媒体（见食谱）

PEI解决方案（见配方）

设备

移液器（各种尺寸）（GILSON）

6管磁选机架（New England Biolabs，目录号：S1506S）

管旋转器（Taiyo，型号：RT-50）（图1A）

CO 2培养箱（SANYO，目录号：MCO-175）

轨道旋转器（东方仪器，目录号：KS-6300）（图1B）

自制吸气器（图1C和1D）

盒式荧光成像装置（Olympus，目录号：FSX100）

图1.设备。 A.管旋转器RT50;轨道旋转器C和D.自制吸气器。

程序

配体涂层Dynabeads的制备
1. 将20μlDynabeads蛋白A用1ml PBS（见食谱）在微管中洗涤。
  
  注意：标准程序可以针对多个样本进行放大。
2. 使用磁分离架收集珠粒。
3. 将溶液从珠粒中取出。
4. 将珠子重新悬浮于100μlPBS中
5. 将2μl100ng /μl的DLL4-Fc / PBS（参见食谱）或JAG1-Fc / PBS（参见食谱）加入到管中
6. 珠子在室温下孵育20分钟或在4℃下过夜，使用管旋转器（视频1）。
7. 使用磁选机架收集珠粒。
8. 将溶液从珠粒中取出。
9. 用1ml PBS洗涤珠子3次。
10. 将溶液从珠粒中取出。
11. 将100μlPBS加入管中。
12. 在使用前，将900μl冰冷的完整培养基加入管中

Notch表达细胞的制备
1. 将HEK293T细胞以6×10 5个细胞/孔接种在6孔板中，在完全培养基中（参见食谱）。
2. 第二天，用800μl的Opti-MEM代替培养基。
3. 将细胞在37℃下在CO 2培养箱中孵育30分钟
4. 将质粒DNA（2μg）在微管中稀释成200μl的Opti-MEM
  注意：为了鉴定转染的细胞，将GFP表达载体（例如，pMAX-GFP）包含在1/8总量质粒中。
5. 管子轻轻旋涡。
6. 将6μl1mg / ml PEI溶液（参见食谱）加入到DNA溶液中
7. 混合物在室温下孵育30分钟
8. 将DNA / PEI混合物轻轻滴在板的每个孔上
9. 将细胞在37℃下在CO 2培养箱中孵育4小时
10. 用2ml的完整培养基代替培养基。
11. 将细胞在37℃下在CO 2培养箱中孵育48小时

结合测定（图2）

图2.结合测定。 A.在15ml管中完成培养基;将动物重悬于完全培养基中;将6孔板中的HEK293T细胞与冷室中的配体偶联珠孵育。 D.用多聚甲醛固定培养板; E.去除PBS前的培养板;使用自制抽吸器从培养板中取出PBS。 G.去除PBS后的培养板; H.用PBS洗涤培养板三次; I.用PBS洗涤五次后的培养板。
1. 用含有DLL4-Fc或JAG1-Fc珠的1ml冰冷的完全培养基代替培养基（图2C）。
2. 细胞在冷室中孵育30分钟
3. 使用吸气器将培养基从培养皿中取出
4. 细胞在室温下用4％多聚甲醛固定20分钟（图2D）
5. 使用轨道旋转器将固定的细胞用5ml PBS洗涤5分钟（视频2）
6. 使用吸气器将PBS从培养皿中取出（视频3）
  注意：可以使用吸气器将积聚在每个孔中心的珠子移除。
7. 通过重复步骤C5和C6，将细胞洗涤5次。
8. 将1ml PBS加入到培养皿的每个孔中（图2I）
9. 使用FSX100捕获相位对比度和荧光图像（图3）
10. 计数GFP阳性细胞上结合的珠粒数（图4）
  注意：计数50个GFP阳性细胞进行定量。排除浮珠以进行计数。
  
  图3. Dynabeads绑定单元格的计数。 A-C。转染表达GFP的HEK293T细胞用对照Dynabeads培养。 D-F。将转染表达GFP，Notch1的HEK293T细胞与DLL4-Fc结合的珠孵育。 G-我。将转染以表达GFP，Eogt和Notch1的HEK293T细胞与DLL4-Fc结合的珠孵育。 A，D和G.相位图像; B，E和H.荧光图像; C，F和I.合并图像。刻度棒=60μm。 C'，F'和I'。图像中盒装区域的放大倍数（C，F，I）。刻度棒=60μm。 C“，F”和I“。与C'，F'和I'相同。红点表示GFP阳性细胞上的结合珠。虚线显示细胞的轮廓。刻度棒=60μm。
  
  图4. Dynabeads绑定细胞的计数分析。 HEK293T细胞或Notch1瞬时转染有或没有Eogt 的细胞与DLL4或JAG1珠孵育。确定用GFP表达标记的转染细胞结合的Dynabeads数（n = 50）。数据是来自三个独立实验的平均值±SD。 * P ＆lt; 0.05; ** 0.01; Welch的测试条。

数据分析

在先前发表的实验（Sawaguchi等人，2017）中，数据显示为来自三个独立实验的平均值±SD。在每个实验中，分析了50个GFP阳性细胞。 Welch的 t -test被使用。

笔记

该协议提供高重现性。计数50个GFP阳性细胞在大多数实验中提供了低变异性。

食谱

胎牛血清（FBS）

将含有FBS的瓶子在56℃下孵育30分钟，然后使用

磷酸盐缓冲盐水（PBS）

10mM Na 2 HPO 4

1.8mM KH PO 4

137 mM NaCl

2.7 mM KCl

100ng /μlDLL4-Fc / PBS和100ng /μlJAG1-Fc / PBS
将DLL4-Fc或JAG1-Fc（5μg）溶于50μlPBS
中
注意：100ng /μlDLL4-Fc / PBS和100ng /μlJAG1-Fc / PBS可以在4℃下储存3个月。

完成文化媒体

含有10％FBS和青霉素 - 链霉素的DMEM

PEI解决方案
1. 将100毫升PEI溶于100ml Milli-Q水中
2. 溶液通过0.22μm的膜进行灭菌
3. 等分试样储存于-30°C

致谢

该协议已经从之前发表的文章（Sawaguchi等人，2017年）进行了修改。这项工作得到日本社会科学促进会授予＃JP15K15064 TO和MO，＃JP26110709 to TO，＃JP26291020 to TO，＃JP15K18502 to MO，＃JP16J00004 to MO;武田科学基金会日本应用酶学基金会TO TO; YOKOYAMA临床药理学基金会＃YRY-1612至MO。

参考

Moloney，DJ，Panin，VM，Johnston，SH，Chen，J.，Shao，L.，Wilson，R.，Wang，Y.，Stanley，P.，Irvine，KD，Haltiwanger，RS和Vogt，TF（2000 ）。边缘是修改Notch的糖基转移酶。自然 406 （6794）：369-375。

Mumm，J.S。和Kopan，R。（2000）。 Notch信号：来自外部。 Dev Biol 228（2）：151-165。

Sawaguchi，S.，Varshney，S.，Ogawa，M.，Sakaidani，Y.，Yagi，H.，Takeshita，K.，Murohara，T.，Kato，K.，Sundaram，S.，Stanley，冈岛，T.（2017）。 NOTCH1上的O-GlcNAc EGF重复调节哺乳动物中配体诱导的Notch信号传导和血管发育。 a> Elife 6.

Stanley，P.和Okajima，T。（2010）。 Notch信号传导中糖基化的作用。 Curr Top Dev Biol 92 : 131-164.