材料和试剂

移液器提示
接种环（10μl）（Copan Diagnostics，目录号：8177CS20H）
铝箔
PVDF膜（0.2μm）（Merck，目录号：ISEQ00010）
小时。幽门螺杆菌细胞
哥伦比亚血琼脂（CBA）板（Autobio Diagnostics，目录号：M0109-2）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：746398-500G）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：746436-500G）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：795410-500G）
磷酸氢二钾（K 2/2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：795496-500G）
NaOH（Sigma-Aldrich，目录号：S5881-500G）
蛋白酶K（Sigma-Aldrich，目录号：P8044-1G）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：24102-5L-R）
SDS（Sigma-Aldrich，目录号：L3771-1KG）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G9012-1L）
Tris碱（Sigma-Aldrich，Roche Diagnostics，目录号：11814273001）
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G8898-1KG）
溴酚蓝（AMRESCO，目录号：0449-50G）
β-巯基乙醇（AMRESCO，目录号：0482-100ML）
周期酸（Sigma-Aldrich，目录号：P7875）
乙酸（BDH，目录号：100015N）
过硫酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：A3678）
氢氧化铵（Sigma-Aldrich，目录号：320145）
硝酸银（Sigma-Aldrich，目录号：209139）
柠檬酸（Sigma-Aldrich，目录号：C7129）
福尔马林（37％甲醛）（Sigma-Aldrich，目录号：252549）
新鲜15％SDS-PAGE凝胶
30％丙烯酰胺/双（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610157）
TEMED（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610801）
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：34860-4X4L-R）
牛血清白蛋白（BSA）（AMRESCO，目录号：0332-100G）
吐温-20（Solarbio，目录号：T8220-500ml）
小鼠抗Le x （Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-59471）
小鼠抗Le y （Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-59472）
小鼠抗Le a （Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-51512）
小鼠抗Le b （Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-51513）
次级兔抗小鼠过氧化物酶缀合的IgM抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories，目录号：315-035-049）
化学发光过氧化物酶底物-1（Sigma-Aldrich，目录号：CPS1120）
PBS（pH 7.2）（10x）（参见食谱）
SDS-PAGE运行缓冲液（10x，参见食谱）
0.1 N NaOH溶液（参见食谱）
LPS裂解缓冲液（参见食谱）
氧化溶液（见配方）
银染溶液（参见食谱）
彩色显影剂溶液（参见食谱）
终止解决方案（见配方）
SDS-PAGE转移缓冲液（10x，参见食谱）
TBS（10x，见配方）

设备

移液器（Eppendorf，目录号：4920000024,4920000059,4920000067,4920000083）
离心机（Eppendorf，目录号：5418 R）
玻璃器皿
水浴
旋转振动筛
细胞电泳槽（Bio-Rad Laboratories，目录号：1658001）
电泳电源（Bio-Rad Laboratories，目录号：1645070）
半干电泳转移系统（Bio-Rad Laboratories，目录号：1703940）
pH计
分光光度计（Shimadzu，型号：UV-1601 UV-Visible）
数码相机
发光图像分析仪（Fujifilm，型号：LAS-3000）

软件

图像读取器LAS 3000 V2.2

程序

LPS样品制备

文化H。幽门螺杆菌菌株在CBA平板上，在微量条件下于37℃孵育24小时。
使用一个环（10μl）收获H。幽门螺杆菌细胞在CBA平板上生长（24小时生长）到1ml冷的1x PBS（参见食谱）中，OD 600处的浊度为3.0。
离心H。幽门螺杆菌细胞在5,000×g下5分钟，弃去上清液。
将沉淀重悬于100μlLPS裂解缓冲液（参见食谱），并将样品在100℃下加热10分钟，并使其在室温下冷却。
向冷却的样品中加入5μl蛋白酶K（20 mg / ml），并在55°C水浴中孵育过夜。
将10μl上述获得的LPS样品/孔加入到15％SDS-PAGE凝胶中，并用1x SDS-PAGE运行缓冲液电泳（参见食谱）。
一旦凝胶电泳完成，从设备中取出凝胶，并剪掉堆积凝胶。

LPS银染

用ddH 2 O冲洗凝胶3次。
将凝胶转移到具有新鲜氧化溶液的另外的器皿（参见食谱），在旋转振荡器上（70rpm / min）氧化20分钟（在本方案中均匀振荡在室温下进行）。
将凝胶转移到单独的清洁剂中，用ddH 2 O 3冲洗并洗涤3次，每次在旋转振荡器上用200ml ddH 2 O处理10分钟。
将凝胶转移到具有新鲜银染色溶液的单独的器皿（参见食谱），在旋转振荡器上染色10分钟。
注意：银染溶液必须是新鲜的，可以在步骤B4的最后洗涤过程中进行。在染色过程中，器皿应用铝箔包裹，但要确保箔片不与溶液接触。
将凝胶转移到单独的清洁剂中，冲洗并洗涤3次，每次在旋转振荡器上用200ml ddH 2 O进行10分钟。
将凝胶转移到具有新鲜显色剂溶液的独立制品（参见食谱）中，在旋转振荡器上培养2-10分钟。
注意：显色剂溶液必须是新鲜的，可以在步骤B6的最后洗涤过程中进行。颜色将在凝胶上发展至2-10分钟，显影剂溶液保持与凝胶接触的时间越长，条带将变得越暗。因此，重要的是观察凝胶的发展。操作者必须决定凝胶是否充分发展，并将凝胶转移到终止溶液中（参见食谱）。
将凝胶转移到具有新鲜终止溶液的单独零件1分钟。然后将凝胶漂洗并储存在ddH 2 O中。
使用数码相机拍摄银色LPS凝胶的图像。

Western blot检测Lewis抗原表达
从步骤A的步骤7开始。

使用1x SDS-PAGE转移缓冲液将LPS从凝胶转移到PVDF膜（参见食谱）
转移完成后，从设备中取出膜。
用ddH 2 O冲洗膜3次。
将TBST（见食谱）含有3％BSA，在旋转振荡器上封闭2小时或4℃过夜。
倾倒阻塞解决方案。
用一级抗体进行检测：小鼠抗Le 或或 a / b （1： 1,500）（Santa Cruz）在含有1％BSA的TBST中，在旋转振荡器上搅拌2小时或在4℃下过夜。
倒出一级抗体溶液
用TBST冲洗和洗涤3次，每次旋转摇床10分钟。
在TBST中用二级兔抗小鼠过氧化物酶缀合的IgM抗体（1：10,000）（Jackson ImmunoResearch Laboratories）探针，在旋转振荡器上1小时。
倒出二抗溶液。
用TBST冲洗和洗涤3次，每次旋转摇床10分钟。
将膜放在一块塑料薄膜上。
在膜上加入约5ml的化学发光过氧化物酶底物-1工作溶液（Sigma-Aldrich）
用第二张塑料薄膜覆盖膜。
使用LAS-3000智能DarkBox（Fujifilm）（软件图像读取器LAS 3000 V2.2）检测化学发光。

数据分析

图1示出了通过银染色和Western印迹分析的幽门螺杆菌野生型菌株26695，P1，B128和J99制备的LPS，使用抗Lewis X（Le < ）和抗Lewis Y（Le y ）。

银染色：染色黑色的快速迁移带表示包含脂质A和核 - 低聚糖（脂质A核）的分子;较慢的迁移带代表O-抗原。显然，来自四个H的LPS制剂。幽门螺杆菌菌株显示不同的染色模式，表明携带不同LPS结构的菌株（图1A）
蛋白质印迹：来自H的LPS。检测到幽门螺杆菌菌株26695，P1和J99，表达Le x 和Le y 抗原（图1B，泳道1,2和4），而LPS制备来自菌株B128未检测到表达Le x / y （图1B，泳道3）。

图1.来自H的LPS的粗制备。幽门螺杆菌菌株用于银染和Western印迹

食谱

注意：除非另有说明，否则O用于准备所有解决方案。

PBS（pH 7.2）（10x）（1L）
80克NaCl
2克KCl
14.4g Na 2 HPO 4
2.4g KH PO 4
加入900ml H 2 O以溶解所有试剂，并将pH调节至7.2，然后加入H 2 O使总体积达到1L。缓冲液为通过高压灭菌消毒并在室温下储存。 1x工作溶液通过将100ml 10×PBS缓冲液与900ml H 2 O 2 /
0.1N NaOH（1L）
4g NaOH
总体积为H 2 O 2的1L。缓冲液通过高压灭菌消毒并在室温下储存
LPS裂解缓冲液（20ml） 2 ml 20％SDS
800μlβ-巯基乙醇
200μl溴酚蓝
2毫升甘油
15 ml 1M Tris-HCl（pH 6.8）
氧化溶液（100ml）
0.7克周期酸
40 ml EtOH
5 ml乙酸
55ml H 2 O O
银染溶液（150 ml）
28 ml 0.1 N NaOH 2ml氢氧化铵（29.4％）
115ml H 2 O ○
5毫升20％硝酸银（w / v）
注意：通过加入28ml 0.1N NaOH，2ml浓氢氧化铵（29.4％）和115ml H 2 O 2，将该溶液按以下顺序混合。在专门的零件中，然后将转盘上的零件（50 rpm / min）转移。最后，将5ml 20％硝酸银滴加到溶液中，等待棕色沉淀物溶解，然后再加入更多的硝酸银溶液。如果棕色沉淀物不能溶解，请丢弃溶液，并通过加入20％硝酸银更缓慢地重新溶解。
显色剂溶液（200毫升）
将1g柠檬酸溶解于20ml H 2 O中，得到5％柠檬酸：
200微升5％柠檬酸
100μl37％甲醛
200ml H 2 O O
终止溶液（100ml）
10 ml醋酸 90毫升ddH 2 O O
SDS-PAGE运行缓冲液（10x）（1L）
30.3克Tris碱基
144克甘氨酸
10g SDS
总体积为H 2 O 2的1L。缓冲液通过高压灭菌消毒并在室温下储存。 1x工作溶液通过将100ml 10x运行缓冲液与900ml H 2 O 2 /
SDS-PAGE转移缓冲液（10x）（1L）
30.3克Tris碱基
144克甘氨酸
总体积为H 2 O 2的1L。缓冲液通过高压灭菌消毒并在室温下储存。 1x工作溶液通过将100ml 10x转移缓冲液与700ml H 2 O 2和200ml甲醇混合而制备，
TBS（10x）（1 L）
80克NaCl
2克KCl
30克Tris碱基
加入900ml H 2 O以溶解所有试剂并调节pH至7.4，然后加入H 2 O使总体积达到1L。放养缓冲液通过高压灭菌消毒并在室温下储存。 TBST是含有0.1％Tween-20（v / v）
的1x TBS

致谢

这里描述的和在Li等人（2017）中描述的这种协议是根据在Apicella等人（2008）和蔡氏等人（1982）。这项工作得到了四川大学华西医院资助，题为“四川大学华西医院”1.3.5“优秀学科项目”（ZY2016201）。

参考

Apicella，M.A。（2008）。脂多糖的分离和表征。方法Mol Biol 431 ：3-13。
Tsai，C.M.和Frasch，C.E。（1982）。用于检测聚丙烯酰胺凝胶中脂多糖的敏感银染色。 Anal Biochem < 119（1）：115-119。