材料和试剂

圆底35毫米共焦盘（MATTEK，目录号：P35G-0-14-C）
24孔板（Corning，Costar ®，目录号：3524）
无菌1.5ml管（Fisher Scientific，目录号：05-408-129）
无菌移液器吸头
细胞系（，即，HeLa）
ArgNP金纳米粒子（水中约50μM），新鲜纯化的Cas9En蛋白（〜10-20μM）和sgRNA（〜150μM）的储备溶液
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（GE Healthcare，HyClone TM，目录号：SH30028.02）
平板DMEM培养基（无血清和抗生素，适用于细胞培养的培养基，例如HeLa细胞）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ，目录号：10567014） >
Alexa Fluor 488 NHS酯（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：A20000）
AmpliScribe T7-Flash-Transcription Kit（Epicentre，目录号：ASF3257和ASF3507）

设备

移液器
在5％CO 2和37℃下的细胞培养培养箱
荧光显微镜（任何共焦显微镜）

程序

图1.方案的示意图。步骤1：形成Cas9En-sgRNA复合物（需要30分钟）;步骤2：形成Cas9En-RNP / ArgNPs纳米组装（需要10分钟）;和步骤3：Cas9En-RNP递送（需要3小时）。

最终工作纳米组装浓度为125nM的ArgNP和62nM的Cas9En-RNP复合物，其浓度为ArgNPs / Cas9En-RNP的2:1摩尔比。所需的纳米组装样品的总体积取决于所用细胞培养板的种类。我们通常使用1毫升圆底35毫米共焦盘，500微升24孔板，每孔200微升96孔板。因此，纳米组件应根据用户的需要进行制作和扩大。以下计算是对于24孔板中的一个样品（即，，总体积为500μl）。此外，以下协议是用于HeLa细胞，然而，我们验证了其他细胞系中的Cas9En-RNP递送，包括小鼠巨噬细胞RAW 264.7，人胚胎肾HEK细胞和人类初级乳腺上皮细胞。

首先，在递送实验之前24小时，将细胞密度为8×10 4个细胞/孔的24孔板上的种子细胞置于细胞/孔中。 br />
在交货的当天，通过在10-20μl的1x PBS缓冲液中以1:1摩尔比混合Cas9En和sgRNA来制备Cas9En-RNP复合物。请记住，500μl样品中最终的Cas9En-RNP浓度应为62 nM（〜5μgCas9En和1μgsgRNA）。
在室温下孵育复合物30分钟
同时，将100μl1x PBS加入无菌的1.5 ml管中
将需要量的ArgNPs加入到含有1×PBS的管中，使500μl样品的ArgNP最终浓度为125nM。通过上下移动混合。
现在，将预混合的Cas9En-RNP复合物添加到管中的ArgNPs溶液中
通过上下移动进行混合。
在室温下孵育样品10分钟。纳米组件将在10分钟内准备就绪，因此用户应在此期间准备传送细胞。
注意：不要孵育超过10分钟，因为这可能导致聚集体形成，而不是明确的组件。
用1x PBS洗涤细胞两次。
当纳米组装样品在10分钟后准备好后，加入〜400μl的DMEM平板培养基（或任何感兴趣的培养基）到管中的纳米组装溶液中。混合好
注意：本步骤应严格避免含有血清的培养基;具有血清的培养基可能需要进一步优化，例如纳米颗粒与Cas9En：sgRNA的比例和孵育时间。
将全部（500μl）样品加入洗涤细胞中。
在适当的条件（通常为5％CO 2和37℃）下孵育细胞3小时。完成Cas9En-RNP交付应在孵化3小时后实现。
3小时后清洗培养基，更换新鲜所需的培养基（含有10％血清和1％抗生素的DMEM，如有需要可补充任何补充剂）。

数据分析

通过共焦显微镜成像测定Cas9En或Cas9En-RNP的细胞质传递效率。在细胞质和细胞核中标记的Cas9En的荧光团的均匀分布被认为是有效递送，而细胞质中的任何点状分布被认为是内体递送（图2A和2B）。简言之，手动计数〜400个细胞以估计有效的胞质和核递送。应该避免标记的Cas9En的任何点状分布（见图2B）计数为直接的细胞质和核递送。请参阅Mout 等。，2017年了解更多详情。

图2.共聚焦显微镜图像，显示培养的HeLa细胞中Cas9E20（Alexa Fluor 488标记）的有效胞质和核递送的实例。A.以2:1摩尔比的ArgNP / Cas9E20; B.通过ArgNP / Cas9E20 1:1摩尔比的内吞作用，Cas9E20的低效递送。请注意，如下所述，通过筛选不同摩尔比的ArgNPs / Cas9En或Cas9En-RNP可以实现最大的细胞质输送效率。

笔记

作为参考，在纳米组装处理48小时后进行基因编辑验证
ArgNPs / Cas9En的比例是提供效率最关键的因素。每一批ArgNPs在表面配体覆盖方面可能略有不同，因此建议用户测试不同比例的ArgNPs / Cas9En，以找出最大的传递。应使用标记有荧光素（FITC / Alexa Fluor 488）的Cas9En来评估传递效率（参见制造商标签协议：Alexa Fluor 488 NHS Ester，Thermo Fisher Scientific）。
新鲜准备（不超过一周，并保存在4°C）Cas9En应用于更好的活动。应该避免在-80℃下用甘油冷冻的Cas9En，因为我们的初步调查显示甘油阻碍了组装形成。

致谢

这项研究得到NIH（GM077173），NSF（CHE-1307021）和UMass OTCV授权的支持。

参考

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