材料和试剂

物料
1. 15ml离心管（Corning，Falcon ®，目录号：352196）
2. 50ml离心管（Corning，Falcon ®，目录号：352070）
3. T75烧瓶
4. 2毫升微管
5. 具有0.4μm孔径膜的Transwell腔室（Corning，目录号：3397）
6. 0.22μm过滤器（EMD Millipore，目录号：SLGP033RS）
7. 具有Ultracel-3膜（分子量截止，3kDa）的Amicon Ultra-15离心过滤器单元（EMD Millipore，目录号：UFC900308）
8. Nunc TM 6孔板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：140675）
9. Nunc TM 96孔平底（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：167008）
10. 24孔板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：140644）
11. 文化幻灯片（Corning，Falcon ®，目录号：354118）
12. 细胞过滤器（尺寸：40μm）（Corning，Falcon ®，目录号：352340）
13. 20μl，100μl和1 ml移液管吸头
14. 5ml，10ml，和50ml血清移液管
15. 低温小瓶1.2ml（Corning，目录号：430487）
16. 50ml注射器（BD，目录号：1018841）
17. 荧光活化细胞分选（FACS）管（5ml圆底聚丙烯）（Corning，Falcon，目录号：352063）
18. FACS管（5ml圆底聚苯乙烯，带有细胞过滤器捕捉帽）（Corning，Falcon，目录号：352235）
细胞
1. 人类MSC：成人BM-MSC购自Lonza（Lonza，USA）
2. 人类ECFCs：如先前报道的（Patel等人，2013）分离人胎盘胎盘ECFCs。为了在共培养后区分MSC和ECFC，我们建议使用目前协议中使用的GFP标记的ECFC，但也可以使用非GFP标记的细胞。
试剂
1. 双蒸水（ddH 2 O）
2. 100％乙醇
3. Dulbecco改性Eagle培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11995073）
4. 胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10437028）
5. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10010023）
6. PBS片剂（Sigma-Aldrich，目录号：P4417）
7. TrypLE表达离解试剂（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：12605093）
8. 胶原，大鼠尾巴（浓缩原料，100x）的I型溶液（Sigma-Aldrich，目录号：C3867）
9. 乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：ARK2183）
10. 内皮基底培养基-2（EBM-2）（Lonza，目录号：190860）
11. 内皮生长培养基-2（EGM-2）BulletKit TM（Lonza，目录号：CC-3162）
  注意：该试剂盒的组分包括以下物质：氢化可的松，GA-1000（庆大霉素，两性霉素-B），hEGF，VEGF，hFGF-B，R3-IGF-1，抗坏血酸，肝素。 >
12. 生长因子减少Matrigel TM Matrix（Corning，目录号：356230）
13. 二甲基亚砜（DMSO）（Fisher Scientific，目录号：BP231-100）
14. 第二抗体山羊抗兔Alexa Fluor 488缀合物（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：A-11034）
15. 第二抗体山羊抗小鼠Alexa Fluor 568缀合物（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A-11004）
16. PE / Cy5缀合的抗人CD90抗体（Thermo Fisher Scientific，eBioscience TM，目录号：15-0909-42）
17. V450小鼠抗人CD31（BD，BD Biosciences，目录号：561653）
18. 7-氨基生物霉素D（7-AAD）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：A1310）
19. 具有4'，6-二脒基-2-苯基吲哚二氢氯化物（DAPI）的延长金试剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：P36935）
20. Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（D-PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：14190250）
21. EDTA（Merck，USA，CAS：6381-92-6）
22. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）
23. 多聚甲醛粉末（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
24. 100％Triton X-100（Fisher Scientific，目录号：BP151-500）
25. 吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416）
26. 青霉素/链霉素10,000U / ml（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
27. 正常山羊血清
28. 台盼蓝色粉末
29. 70％乙醇（见食谱）
30. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
31. 涂层溶液（见配方）
32. 完成EGM2培养基（见食谱）
33. 冷冻介质（参见食谱）
34. FACS缓冲区（见配方）
35. 4％多聚甲醛（PFA）（见配方）
36. 0.1％Triton X-100（参见食谱）
37. 洗涤液（参见食谱）
38. 抗体稀释液（见配方）
39. 阻塞解决方案（见配方）
40. 0.4％台盼蓝溶液（见配方）

设备

水浴
冰箱
便携式吸管
离心机（Eppendorf，目录号：5810 R）
层流工作台
离心机
振动器
组织培养箱设置在37℃，5％CO 2（Memmert GmbH＆amp; Co.，Nurnberg，Germany）上
血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：3110）
IncuCyte Zoom（埃森生物科学）
蔡司Axio显微镜（Carl Zeiss）
荧光活化流式细胞术（FACS）Aria 11u系统（BD Biosciences，FACSAria TM）
Gallios流式细胞仪（Beckman Coulter，Fullerton，CA，USA）

软件

Kaluza流式细胞分析软件
GraphPad Prism 7软件
ZEN 2.3（Blue edition，Carl Zeiss Microscopy GmbH）
ImageJ（斐济）

程序

细胞培养和维护
为了在共培养后区分MSC和ECFCs，使用制造商的方案对ECFC进行GFP标记（ https://www.systembio.com/products/imaging-and-reporter-vectors/bioluminescent-imaging-vectors/bliv101-cmv-gfp- t2a-luciferase / System Biosciences，Mountain View，CA，USA）。或者，可以通过其也称为CD31的血小板内皮细胞粘附分子（PECAM-1）的高表达水平从MSC鉴定ECFC。
1. 涂层溶液的制备与应用
2. 体外培养和冷冻胎盘ECFCs和BM-MSC
共培养试验
1. MSC和ECFC的直接共同文化
  为了研究MSCs共培养对应激条件（这里为血清剥夺条件）的ECFCs存活的影响，将MSC和ECFCs单独共同培养在EBM-2中（图1A）。
2. 间接共培养人类间充质基质细胞（MSC）和ECFC
  为了评估细胞接触对ECFC存活的影响，使用具有0.4mm孔径膜的Transwell腔进行间接共培养实验（图1C）。
MSC衍生条件培养基（MSC-CM）的制备和应用
为了研究MSC分泌因子对ECFCs的贡献，在MSC-CM存在下培养ECFC（图1D）。
1. 培养5×10 5个具有EBM-2的T75烧瓶中的MSC，并在正常细胞培养条件下孵育。
2. 48小时后，收集上清液并以330×g离心5分钟以除去任何死细胞。
3. 通过0.22μm过滤器过滤上清液，以除去任何剩余的细胞碎片。可立即使用MSC-CM。
4. 同时，在T75组织培养瓶中EGM2中培养5.0×10 5个ECFC。 4小时后，取出培养基并用PBS洗涤培养物，并用MSC-CM培养ECFC并在正常培养条件下孵育。
5. 48小时后，取出上清液，然后使用血细胞计数器通过台盼蓝排除法计数活的ECFCs数。作为对照培养，在EBM-2和EGM2中使用ECFCs。
  注意：MSC-CM可以在-20°C使用前储存。
6. MSC-CM可以使用中心柱进行浓缩。在层流罩下，根据制造商的说明书，使用Ultracel-3膜柱组装Amicon Ultra-15离心过滤器。
7. 将15ml MSC-CM加入柱的装载室（顶部）。在4℃下以4,000xg离心30分钟。浓缩的MSC-CM可以立即转移到ECFC的顶部，或者可以在-20℃下储存。推荐使用50倍的浓缩液。
8. 同时，用含有EGM2的胶原蛋白包被的6孔板（5×10 4 /孔）培养ECFC并置于培养箱中。 4小时后，取出培养基，用PBS洗板，并将浓缩的MSC-CM放在ECFC的顶部
9. 48小时后，使用血细胞计数器通过台盼蓝排除法计数可行的ECFCs数。作为对照，EBM-2和EGM2培育ECFCs。
  
  图1.用于研究与体内内皮细胞集落形成细胞（ECFC）共培养的间充质干细胞（MSC）的作用的方案。 A.直接共培养MSC和ECFC在无血清培养基中; B.生长培养基中直接共培养; C.间接共培养MSC和ECFC; D.收集MSC条件培养基（MSC-CM）并提供ECFC培养物。
免疫染色分析
1. 在含EGM2的胶原包被的培养载玻片中共培养5.0×10 3个MSCs和5.0×10 3个ECFCs，并在正常条件下孵育。每隔一天更换一次媒体。
2. 4天后，丢弃培养基，使用DPBS洗涤培养物，并在4℃下用PBS中的4％多聚甲醛（PFA）溶液（参见食谱）固定20分钟（自制PBS用于免疫染色实验）。
  注意：对于CD31免疫染色，在4℃下使用2％PFA 15分钟，或在4℃下使用冷冻冷丙酮10分钟。
3. 在室温（RT）下，用PBS / Triton X-100（0.1％）（参见食谱）将细胞渗透10分钟。
  注意：用PBS / Triton X-100（0.1％）过量培养可能会破坏细胞形态。
4. 为阻断非特异性蛋白质结合位点，用PBS封闭溶液洗涤载玻片（见食谱）20分钟。
5. 然后，在抗体稀释溶液（PBS / BSA [3％] /吐温[0.1]）中稀释的CD31（1:50），CD144（1:100）和CD90（1:100）％]，请参阅食谱）。
6. 用300μlPBS /吐温（0.1％）溶液洗涤载玻片5分钟。重复三次。
7. 然后，用PBS稀释溶液（PBS / BSA [3％] /吐温[0.1％]）的250μl二次抗体在室温孵育载玻片45分钟。
8. 用300μlPBS /吐温（0.1％）溶液洗涤载玻片5分钟。重复三次。
9. 根据制造商的说明，将培养皿的上部隔离开。
10. 在8孔板的每个孔中放入一滴具有DAPI的Prolong Gold试剂，并用盖玻片覆盖8个孔，并在Axio显微镜下观察。
预处理ECFCs的准备
1. 在具有EGM2的胶原包被的T75组织培养烧瓶中共培养2.5×10 5个MSCs和2.5×10 5个ECFC，并在正常条件下孵育。每隔一天更换一次媒体（图2A）。图3显示了ECFC单独或与MSC在EGM2中共培养4天的代表性图像
  
  图2.引发内皮细胞集落形成细胞（ECFC）的制备（A）和表征（B）。 MSC：间充质干/基质细胞
  
  图3.单独的GFP标记内皮集落形成细胞（ECFC）的代表性图像或与EGM2中的间充质干/基质细胞（MSC）共培养4天。顶部面板：合并相位对比和荧光图像;下面板：相位对比图像。比例尺=100μm
2. 4天后丢弃培养基，使用DPBS洗涤培养物，并使用TrypLE-express解离试剂分离细胞并计数。在330℃下将细胞分解5分钟，并将其重悬于100μl冰冷的FACS缓冲液中，并用小鼠PE / Cy5缀合的抗人CD90抗体（1:100稀释）和7- 4℃下的氨基生殖霉素D（7-AAD，1:50稀释）和V450缀合的抗人CD31抗体（1:50稀释）。
3. 20分钟后，以330×g离心细胞4分钟，并将细胞重悬于100μl冰冷的FACS缓冲液中。
  注意：当进行流式细胞术时，单个染色的样品对于确定染色和补偿的水平很重要，因此建议单独用于CD90抗体的MSC和CD31的ECFC染色。死细胞可能导致由于自体荧光引起的假阳性结果，并增加非特异性结合的水平。因此，也推荐使用活/死标记来消除死细胞。
4. 在通过FACS机器运行样品之前，通过40μm的细胞过滤器过滤细胞以减少细胞聚集。在Falcon圆底聚丙烯管中的冰冷FBS中将GFP + CD90 - CD31 + 细胞（底漆-ECFCs）排序。
  注意：PBS中的分选细胞（或含有BSA / FBS的PBS）的活力有限，因此建议在FBS中进行分选。
5. 然后可以对这些细胞进行管形成测定，限制稀释测定和基因表达分析。
6. 在单独的实验中，以及作为对照培养ECFC，在具有EGM2的T75烧瓶中单独培养4天，并分选GFP + CD90 CD31 + 细胞。
  注意：在第2天更换培养基。
管形成试验
1. 解冻Matrigel TM 在4°C使用前一天。
2. 预先将24孔板和吸头在4℃预冷2-3小时
3. 将预先冷冻的24孔板在冰上每孔100-150μlMatrigel TM（图2B）。
  注意：确保Matrigel TM 均匀地分布在孔中，并尝试避免凝胶内形成气泡。 Matrigel TM 不能干。
4. 将涂布板放在培养箱中（加湿37℃的培养箱），使凝胶聚合30至60分钟。
5. 将从排序（底漆ECFCs）收获的ECFC转移到15 ml管中，并以330 x g旋转5分钟。去除上清液并将细胞重新悬浮在新鲜的EGM2中。对细胞进行计数，并将400μl的底漆ECFC（1.0×10 4 / sup>）分配到Matrigel TM 涂层的孔中。使用1.0 x 10 4 非底漆ECFC作为对照。
6. 将板放在IncuCyte ®活细胞分析系统中，每2小时捕获相位对比度和荧光图像48小时。计数毛细管样结构。图4显示了在Matrigel TM上种植的已引发ECFCs的代表性图像。
  
  图4. 24小时后接种于Matrigel TM上的起始内皮细胞集落形成细胞的代表性图像（左：相位对比度，右：与荧光相结合的相位对比）。比例尺=100μm。
单细胞测定
1. 在层流罩下将所需数量的96孔板用50μl涂层溶液涂覆3-4小时，并确保涂层溶液均匀分布在孔上（图2B）。建议在涂层步骤中新鲜涂布涂层溶液并对其进行脱膜，以获得最佳性能
2. 彻底丢弃涂层介质，并用PBS轻轻洗涤烧瓶。重复洗涤步骤两次。
  注意：涂层的96孔板可以在4℃保存最多1个月。
3. 在细胞培养之前，将100-150μlEGM2等分至96孔板的每个孔中
4. 通过使用BD FACSAria分选机在每个孔中种上一个单一的底漆或非底色ECFC（GFP + CD90 - CD31 + ）。在正常的细胞培养条件下孵育平板，并用新鲜的EGM2每周更换培养基，通过除去一半的培养基并用新鲜的EGM2代替。
5. 2周后，在光学显微镜下观察细胞，计数/评分菌落。内皮集落可以作为内皮簇（ECs; <50细胞），低增殖潜能EPCs（LPP; 50-2,000个细胞）和高增殖潜能EPCs（HPP;> 2,000个细胞）评分（图5）。 />
  
  图5.在10天后进行单细胞测定的起始内皮细胞集落形成细胞的代表性图像。内皮细胞集合可以作为内皮簇（EC），低增殖潜能内皮祖细胞（EPCs） LPP）和高增殖潜能EPCs（HPP）。比例尺=100μm

数据分析

Kaluza软件可用于分析流量数据。对于直接和间接共培养测定，应使用至少六个生物重复。对于至少3次独立实验，限制性稀释和管形成测定分别进行一式三份和一式四份。对于管形成测定，我们在至少20个视野中计数毛细管样结构
所有统计分析都可以使用GraphPad Prism 7软件进行。配对或不配对的学生测试可用于确定不同组之间的统计差异。

笔记

为了更好的功能和重复性的结果，我们建议在所有实验的第3-5节使用干细胞/祖细胞。
需要在使用当天准备FACS解决方案，培养基，免疫染色解决方案以获得最佳效果
所有细胞培养试剂应在37°C使用前加温。
为了在FACS分选过程中获得最高的生存力，细胞应保持在冰上
我们建议将胶原I型溶液保持在2-8°C。涂布后，通过抽吸完全除去涂层溶液，然后用PBS轻轻洗涤，并保持在2-8°C使用前。涂覆的烧瓶/板应储存在2-8°C。我们建议在1个月内使用涂层烧瓶。

食谱

70％乙醇（1升）
700 ml 100％乙醇 300毫升去离子水
磷酸盐缓冲盐水（PBS，1L）
注意：这是自制PBS，仅用于免疫染色实验。
10个PBS片剂
1000毫升MilliQ水
胶原涂层溶液（100ml）
1000μl胶原溶液（浓缩原液，100x）
560μl冰醋酸
99 ml无菌PBS
完成EGM2培养基（EBM TM -2加上生长补充剂的SingleQuots TM / sup>）（500ml）
500 ml EBM TM -2
10ml胎牛血清（FBS）
0.5 ml hEGF
0.2 ml氢化可的松
0.5 ml GA-1000（庆大霉素，两性霉素B）
0.5 ml VEGF
2.0 ml hFGF-B
0.5ml R3-IGF-1
0.5毫升抗坏血酸
0.5毫升肝素
冻结介质
90％FBS
10％DMSO
FACS缓冲区
1x D-PBS
2.5 mM EDTA
0.5％BSA
4％多聚甲醛（PFA）（1升）
40克多聚甲醛粉末 1000毫升PBS
0.1％Triton X-100（1L）
1毫升Triton溶液
1000毫升PBS
免疫荧光染色洗涤液（1升） 1毫升吐温20
1000毫升PBS
抗体稀释溶液免疫荧光染色
DPBS，pH 7.2-7.4
3％BSA
0.05％吐温20
免疫荧光染色的阻断溶液（100 ml）
20毫升正常山羊血清
80 ml免疫荧光清洗液
0.4％台盼蓝溶液（RT）
4毫克台盼蓝粉末 1 ml 1x PBS
注意：对于细胞计数，用0.4％台盼蓝溶液以1:1的稀释液稀释细胞悬液，孵育1-2分钟。

致谢

该协议已经从以前发表的文章（Shafiee等人，2017年）进行了修改和略微修改。本研究得到国家卫生和医学研究理事会项目资助。

参考

Ingram，D.A.，Mead，L.E.，Tanaka，H.，Meade，V.，Fenoglio，A.，Mortell，K.，Pollok，K.，Ferkowicz，M.J.，Gilley，D.and Yoder，M.C。（2004）。使用人类外周血和脐带血鉴定内皮祖细胞的新颖等级。血液 104（9）：2752-2760。
Medina，RJ，Barber，CL，Sabatier，F.，Dignat-George，F.，Melero-Martin，JM，Khosrotehrani，K.，Ohneda，O.，Randi，AM，Chan，JKY，Yamaguchi， Hinsbergh，VWM，Yoder，MC和Stitt，AW（2017）。内皮祖细胞：关于术语的共识声明。干细胞翻译Med < 6（5）：1316-1320。
Patel，J.，Seppanen，E.，Chong，M.S.Yeo，J.S.Teo，E.Y.，Chan，J.K.，Fisk，N.M。和Khosrotehrani，K。（2013）。来自人类胎盘的胎儿内皮细胞集落形成细胞的前瞻性表面标记物分离和扩增。 / a> Stem Cells Transl Med 2（11）：839-847。
Shafiee，A.，Fisk，N.M.，Hutmacher，D.W.，Khosrotehrani，K.and Patel，J。（2015）。来自人类胎盘的胎儿内皮和间充质祖细胞：潜力和临床潜力。 Stem Cells Transl Med 4（5）：419-423。
Shafiee，A.，Patel，J.，Wong，H.Y.，Donovan，P.，Hutmacher，D.W.，Fisk，N.M.和Khosrotehrani，K.（2017）。间充质小窝中内皮细胞集落形成细胞的引发通过协调开发间充质转化来改善移植和血管发生的潜力通过NOTCH信令。 FASEB J 31（2）：610-624。