材料和试剂

移液器提示（Corning，Axygen ®目录号：T-1000-B-R-S，T-200-Y-R-S）
细胞培养皿（35×10mm）（3.5cm培养皿）（Corning，目录号：430165）
1.5ml离心管（Corning，Axygen ，目录号：MCT-150-C）
50ml离心管（Corning，目录号：430290）
100μm细胞过滤器（Corning，目录号：431752）
新生儿Sprague-Dawley（SD）大鼠（出生2-4天，P2-4）
蒸馏水
75％乙醇
Hank的平衡盐溶液（HBSS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：C14175500BT）
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐（PLL）（Sigma-Aldrich，目录号：P1274）
0.25％胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25200072）
胎牛血清（FBS）（Mediatech，目录号：35-076-CV）
Dulbecco修改Eagle's Medium / Ham's F-12 50/50 Mix（DMEM / F12）（Mediatech，目录号：10-092-CV）
胞嘧啶阿拉伯糖苷（AraC）（Sigma-Aldrich，目录号：C1768）
福斯柯林（Sigma-Aldrich，目录号：F6886）
重组人类胰腺β-1（Heregulin）（PeproTech，目录号：100-03）
二甲基亚砜（DMSO）（MP Biomedicals，目录号：196055）
青霉素/链霉素（Pen / Strep）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Beyotime Biotechnology，目录号：C0221A）
多聚甲醛（PFA）（广东光华科技，目录号：1.17767.014）
明胶（Sigma-Aldrich，目录号：G7041）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：V900502）
4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Sigma-Aldrich，目录号：D9542）
兔抗体（GFAP）产生的抗胶质纤维酸性蛋白抗体（Sigma-Aldrich，目录号：G9269）
抗-S-100蛋白抗体，小鼠中产生的克隆15E2E2（S100）（Merck，目录号：MAB079-1）
抗兔神经生长因子受体抗体p75（P75）（Merck，目录号：AB1554）
Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG（H + L）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A-11001）
Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG（H + L）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A-11008）
100x PLL（见配方）
10％FBS（见配方）
1,000x AraC（见配方）
500x蛋黄（见食谱）
10,000x毛喉素（见食谱）
SC培养基（见食谱）
4％多聚甲醛（PFA）（见配方）
0.1％Triton X-100（参见食谱）
阻塞缓冲区（见配方）
1,000x DAPI（见配方）

设备

移液器（Eppendorf，型号：Research Plus ，200μl，1000μl）
CO 2/2培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Model 3100 Series，目录号：3111）
组织培养罩（AIRTECH，目录号：SW-CJ-1F）
手术剪刀和镊子（RWD Life Science，目录号：S14001-15，F13024-13，S12003-09，F13029-10，见图1A）
注意：S14001-15和F13024013 是剪刀和用于斩首的镊子，S12003-09和F13029-10是用于皮肤解剖的剪刀和镊子。
春季剪刀（66 Vision，目录号：54053B，参见图1B）
精镊子（Fine Science Tools，Dumont，型号：＃5，目录号：11252-23，尖端为0.1×0.06mm，见图1B）
超细镊子（Fine Science Tools，Dumont，型号：＃5，目录号：11252-20，尖端为0.05×0.02mm，见图1B）
解剖板，针和冰袋
水浴（宁波科技生物科技，型号：GH-15）
立体显微镜（Olympus，型号：SZ61）
离心机（Eppendorf，型号：5430）

图1.解剖工具。 A.手术剪刀和镊子用于斩断大鼠和解剖皮肤。 B.弹簧剪刀和细镊子用于分离肌肉，开放脊椎椎板并收集脊髓神经

程序

制备
1. 在37℃，CO 2培养箱中，将一个3.5厘米的培养皿与1毫升PLL溶液（0.1毫克/毫升的蒸馏水，见食谱）一起覆盖。
2. 将剪刀和镊子浸入75％乙醇中30分钟灭菌，然后将其暴露于紫外线下30分钟，风干。
3. 用紫外线灭菌30分钟的解剖室（待解剖的大鼠）
4. 通过抽吸去除PLL溶液，并用蒸馏水彻底冲洗盘表面两次。在剥离前将组织培养罩中的PLL涂层盘空气干燥。
5. 准备两个3.5厘米的菜肴，将1.5毫升冷HBSS吸取到每个菜肴上，并将它们放在冰袋上
6. 对于要使用的每只大鼠小鼠，将1ml 0.25％胰蛋白酶-EDTA的等分试样置于37℃的水浴中预热。
组织收集
1. 通过在冰上冷却使其停止移动来麻醉新生大鼠（出生2-4天）。
  注意：动物使用由南方医科大学动物护理使用委员会根据动物道德治疗指南批准。所有努力都是为了尽量减少动物的牺牲和痛苦。
2. 用75％乙醇灭菌大鼠。
3. 用大手术剪刀和镊子快速斩首大鼠，将头部放入收集袋中。
4. 将大鼠放置在解剖板上，并以倾斜姿势（背侧向上），并用针将四肢插入（参见图2A）。
5. 使用一套小型剪刀和镊子，沿着中线从头部到尾部切割背部皮肤，将皮肤从身体分离为内侧至外侧（见图2B）。
6. 使用弹簧剪刀和细镊子，将肩胛骨与骨架分开，并将肩胛骨固定在解剖板上。
7. 使用弹簧剪刀和细镊子，仔细暴露臂丛，并将结缔组织与神经分离。然后切断远端的神经（参见图2C和2D）。
8. 使用弹簧剪刀和精细镊子，将腿筋肌肉从膝盖小心地分离到髋骨以暴露坐骨神经。然后切断远端的坐骨神经（见图2E）。
  注意：不要在步骤B7和B8切割神经的近端。在这些步骤中神经没有被直接解剖出来。相反，如以下步骤B11所述，神经应该从椎间孔被拉出。
9. 使用弹簧剪刀和细镊子切割双侧椎弓并将脊椎椎板从头端移至尾部以露出脊髓（见图2F）。
10. 使用弹簧剪刀和精细镊子，小心地取出脊髓，露出背根神经节（见图2G和2H）。
11. 使用细镊子，小心抓住神经节，然后将连接的脊髓神经拉出，并放入带有冰冷HBSS的3.5厘米盘中。重复这一步骤，从尾部收获所有的脊神经，到脊柱（主要包括臂丛神经，肋间神经和坐骨神经）（见图2I和2J）。
  注意：
  1. 通过抓住椎管（椎管）内侧的神经节，可以方便地找到并收集所有脊神经。
  3. 神经的收获最容易在立体显微镜下完成。非常建议。
12. 使用超细镊子去除粘附于神经的结缔组织，用精细剪刀切断神经节。将干净的神经转移到冰冷的HBSS的另一个3.5厘米的盘中。重复此过程以清除所有神经（见图2K和2L）。
  注意：
  2. 每个收集的神经在近端具有神经节。神经节看起来像神经的头部，比神经更透明（见图2K，箭头）。同时，出现作为血管膜质组织的罕见结缔组织可能会粘附于神经（见图2K，箭头）。
  3. 通过椎间孔牵引收获的神经总是没有神经尿，因为神经尿与椎间孔紧密相连。这是该协议的主要优点。由于传统的方法不可避免地带来紧紧包裹神经的神经尿（Weinstein et al。，2001; Tao，2013）。神经尿是SC培养物中污染细胞（如成纤维细胞）的主要来源。
  4. 本方案的另一个优点是可以从传统方法中获得大量的神经，而不仅仅是两个坐骨神经。因此，牺牲的动物可以显着减少。
    
    图2.收获脊髓神经的逐步程序。 A.斩断的大鼠幼鼠被固定在解剖板上。 B.背部皮肤被切割并与身体分离。 C.肩胛骨与骨干分离并固定在解剖板上。 D.臂丛被暴露，其远端被切割。 E.坐骨神经被暴露，其远端被切割。 F.通过椎板切除术使用一对弹簧剪刀打开椎管。 G.将脊髓从颈部拖到尾部。 H.脊髓被去除后，背根神经节被暴露（箭头）。示意图显示脊髓神经（蓝色），主要包括可用于收获的臂神经神经（BPN），肋间神经（ICN）和坐骨神经（SN）。脊髓（SC）以黄色表示。一个代表性的图像显示神经通过椎间孔（箭头）被拖出，而一些背根神经节留在孔中（箭头）。收集的神经有神经节（箭头），有时带有结缔组织（箭头）。离开神经节和结缔组织后的神经。
解离和细胞播种
1. 将清洁的神经转移到1.5ml管中，将神经切成0.5-1mm长的小块。
2. 将1ml预热的0.25％胰蛋白酶-EDTA加入管中。盖上管子，并在37°C水浴中孵育30分钟，间歇振动每10分钟一次
3. 通过将100μlFBS补充到培养基中终止胰蛋白酶消化。然后用1 ml移液管吸头轻轻地将样品30-35次，使单细胞悬浮注意：轻轻地研磨以避免气泡形成和飞溅。在上下移动30-35次之后，细胞悬浮液中残留有一些残留物。
4. 通过100μm的细胞过滤器过滤细胞悬浮液以除去残留的块注意：团块主要是轴突碎片和未分离的组织。
5. 在室温（RT）下将细胞悬浮液以106 x（Rcf）离心10分钟，弃去上清液。
6. 将细胞沉淀重悬于DMEM / F12中的300μl10％FBS中（参见食谱）。在干燥的PLL涂覆的3.5厘米盘的中间装入细胞悬浮液。不要摇动盘子，以免细胞悬浮液散开，粘在盘子的墙壁上。将细胞培养在CO 2培养箱中2小时以促进细胞附着注意：
  1. 在我们的常规实践中，可以从每只大鼠获得总数为〜1×10 6 的细胞。
  2. 最小化电镀培养基（300μl10％FBS）的体积可以增加细胞密度并促进细胞附着于培养皿。
7. 细胞附着于盘后，将1 ml 10％FBS加入盘中
净化和膨胀
1. 在第二天，用含有10％FBS和10μMAraC的DMEM / F12替代培养基（参见食谱）以消除污染的成纤维细胞。
  注意：在没有促有丝分裂因子的情况下，如肌肉和毛喉素，SCs增殖相当缓慢，而成纤维细胞快速增殖。 AraC是一种抗代谢剂，会损害DNA合成并杀死分裂细胞。因此，成纤维细胞被有效地消除，而SC在适当的治疗时间（48小时）内良好地存活。
2. 48小时后，用SC培养基更换培养基（参见食谱）以扩大SC。
3. 当培养物达到90％汇合时，细胞以1:3的比例常规传代以扩增细胞。来自3-5 th 段的细胞用于实验中的实验。
  注意：3-5代的原代培养的SCs代表双极和三极体形状（参见图3A）。这些细胞的纯度可以达到98％，通过SC特异性标志物的免疫染色鉴定（见图3B-3D）。我们发现，SCs传播5次以上后，慢慢增长。此外，关于SC生物学的大多数发表的论文表明，来自新生大鼠的原代SC用于3-5 段落中。所以，在我们的实验室里，所有用于研究的SC都来自3-5 th 段落。

数据分析

为了确定我们文化中SCs的纯度，使用GFAP，P75和S100作为SC的特异性标记物，作为我们以前的报告（Wen等人，2017）进行免疫染色。简言之，培养的细胞用4％PFA固定（参见食谱）20分钟。然后用0.1％Triton X-100（参见食谱）将细胞穿透30分钟，并在室温下与封闭缓冲液（参见Recipes）一起孵育1小时。然后将细胞在4℃下与一抗（1：400稀释在封闭缓冲液中）孵育过夜，随后在室温下与Alexa-488荧光偶联的二抗（1:400稀释在封闭缓冲液中）孵育2小时。免疫染色后，将细胞与1μg/ ml DAPI（参见食谱）在室温下孵育5分钟以染色核。如图3所示，纯化的SCs显示双极或双极形状，对于S100，GFAP和P75等特异性标志物是阳性的。

图3.鉴定培养的雪旺氏细胞。 A和A'。在相差显微镜下的原代培养的SCs显示双极或三极的形状。 B-D”。通过用包括S100（B，B'），GFAP（C，C'）和P75（D，D'）的特异性标记的免疫染色鉴定原代SC。

食谱

100倍聚-L-赖氨酸氢溴酸盐（PLL）
将500毫克PLL粉末溶于50ml蒸馏水中，制成100克/毫升的100倍储备溶液
10％胎牛血清（10％FBS）DMEM / F12培养基将5ml FBS和500μlPen / Strep稀释到44.5ml Eagle's培养基/ Ham's F-12 50/50 Mix（DMEM / F12）的Dulbecco's修饰物中。
1,000x胞嘧啶阿拉伯糖苷（AraC）
将4.86 mg AraC溶解于2 ml蒸馏水中，制成10 000份1000x储备溶液，并通过过滤消毒溶液。储存于-20°C，避光保存
5,000x asgulin
将50μg蛋黄溶解在1ml无菌的0.1％牛血清白蛋白（BSA）中以制备50ng /μl的5,000x储备溶液
10,000x福斯柯林
将10毫克的毛喉素溶解在812微升的DMSO中以制备10,000x的30mM的储备溶液
SC培养基
含有10ng / ml蛋黄，3μM毛喉素和1％Pen / Strep的3％FBS补充的DMEM / F12
稀释1.5ml FBS，10μl5,000x Heregulin，5μl10,000x Forskolin和500μlPen / Strep到48ml DMEM / F12中
4％多聚甲醛（PFA）
在100ml PBS中稀释4 g PFA 在65℃下搅拌直到完全溶解，并在4℃下储存
0.1％Triton X-100
将100μlTriton X-100稀释到100ml PBS中
阻塞缓冲区
将0.5 g明胶（5％，w / v）溶于10ml PBS中，加入300μlTriton X-100（0.3％）至缓冲液
1,000x4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）
将5mg DAPI溶解在5ml蒸馏水中，制成1mg / ml的1,000x储备溶液，然后用PBS稀释至1x，然后使用

致谢

该协议改编自以前发表的文章（Wen等人，2017）。这项工作得到了国家重点基础研究计划（2014CB542202和2014CB542205），国家自然科学基金（30973095,81371354＆amp; 81571182）的支持。广州科技项目（12C32121609）和广东省自然科学基金（S2013010014697）至郭国。

参考

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