材料和试剂

EDTA游离蛋白酶抑制剂（F.Hoffmann-La Roche，目录号：05892988001）
蛋白酶体抑制剂MG-132（Calbiochem ，目录号：474790-5MG）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
Tris
Ni-NTA-琼脂糖珠（QIAGEN，目录号：30210）
尿素
胍盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：G4505-25G）
咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：12399）
Triton X-100
甘油
β-巯基乙醇
SDS
溴酚蓝
裂解缓冲液（见配方）
洗涤缓冲液（见配方）
洗脱缓冲液（见配方）
4x laemmeli缓冲区（参见配方）

设备

离心机
超声波仪
Western印迹设备
组织培养板
1.5 ml eppendorf管
15 ml falcon管

程序

在10cm组织培养板上种1×10 6个细胞
8-12小时后（约40％的汇合）细胞用0.8μgHis标签蛋白的质粒转染。
在停止培养前4小时，加入蛋白酶体抑制剂MG-132至终浓度为25μM。
转染后48小时，吸出培养基，用预冷的PBS洗涤细胞两次（细胞可以保持在-80℃的板上冷冻，直到纯化的天为止）。
用1ml裂解缓冲液刮取细胞，并将其转移到1.5ml eppendorf管中。
在冰上超声处理细胞两次，每次1分钟（超声波探针应在裂解液表面下方，以避免起泡，但注意不要接触埃彭道夫管壁）。
在4℃下以11,000rpm旋转细胞10分钟。
将上清液转移到15 ml falcon管中，加入4 ml更多的裂解缓冲液
加入75μL用裂解缓冲液预平衡的125μLNi 2+ 2+ -NTA-琼脂糖珠（取150μLNi 2+ + -NTA-琼脂糖珠，并旋转2分钟， 4,000rpm，弃去上清液，用150μl裂解缓冲液洗涤4次，最后加入75μl裂解缓冲液并使用）。
在室温下轻轻摇动孵育4小时
在室温下孵育珠子用以下缓冲液洗涤珠子5分钟：
1. 一次在裂解缓冲液中。
2. 一次在洗涤缓冲液中。
3. 两次在洗涤缓冲液加0.1％Triton X-100（每次4,000 rpm旋转2分钟，以回收珠子）。
洗脱产物通过将珠子在75μl洗脱缓冲液中孵育20分钟，在RT轻轻搅拌。
旋转珠子，将上清液转移到eppendorf
加入4x laemmeli缓冲液，煮沸进行western印迹分析

食谱

裂解缓冲液
6M盐酸胍
0.1M Na 2 HPO 4钠/NaH 2 PO 4 4/1/2 10mM Tris-HCl（pH8）
0.005 M咪唑 0.01 Mβ-巯基乙醇
洗涤缓冲液
8 M尿素
0.1M Na 2 HPO 4钠/NaH 2 PO 4 4/1/2 10mM Tris-HCl（pH6.8） 0.005 M咪唑 0.01 Mβ-巯基乙醇
洗脱缓冲液
0.2 M咪唑 0.15 M Tris-HCl（pH 6.8）
30％甘油 0.72μMβ-巯基乙醇 5％SDS
4x laemmeli缓冲区
2ml 1M Tris-HCl（pH 6.8）
4.0ml 20％（w/v）SDS
4.0ml甘油 4mg溴酚蓝
0.2ml14.3μMβ-巯基乙醇

致谢

该方案改编自Gajjar等人（2012）。这项工作得到INSERM，La Ligue Contrele Cancer和RECAMO CZ.1.05/2.1.00/03.0101的支持。 M.M.C. 由JSPS，AXA研究基金和葡萄牙基金会赞助。 M.G. 得到了印度 - 法国促进高级研究中心（IFCPAR）和ARC的研究奖学金的支持。

参考文献

Gajjar，M.，Candeias，M.M.，Malbert-Colas，L.，Mazars，A.，Fujita，J.，Olivares-Illana，V.and Fahraeus，R。（2012）。 p53 mRNA-Mdm2相互作用控制Mdm2核转运并且是DNA损伤后p53活化所需的。 Cancer Cell 21（1）：25-35。
Xirodimas，D.，Saville，M.K.，Edling，C.，Lane，D.P.and Lain，S。（2001）。 p14ARF对体内泛素化p53和Mdm2的水平的不同影响。 Oncogene 20（36）：4972-4983