材料和试剂

移液器吸头 - 1000μl吸头（OHAUS，产品目录号：PCB-1000），200μl吸头（Neptune Scientific，目录号：2100）
14毫升圆底管（SPL，目录号：40014）
15ml锥形离心管（Ihanil Scientific，目录号：LP-00015CP-00）
60毫米细胞培养皿（SPL，目录号：20060）
微量离心管（SARSTEDT，目录号：72.690）
X光胶片暗盒（Advansta，目录号：L-07019-001）
X光片（XSANATEC，AGFA，目录号：EA75Q）
细胞刮刀（SARSTEDT，目录号：83.1832）
离心瓶（Sigma-Aldrich，目录号：B1033）
pGEX-4T-3载体（GE Healthcare，目录号：28-9545-52）
pFLAG-CMV4载体（Sigma-Aldrich，目录号：E7158）
Flag-NLK载体（Ishitani等人，1999）
感受态细胞-BL21（DE3）（EMD Millipore，Novagen，目录号：70235）
（人）HEK293细胞（ATCC，目录号：CRL-1573）
氯化锌（ZnCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：229997）
异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（Bio Basic，目录号：IB0168）
谷胱甘肽琼脂糖4B（GE Healthcare，目录号：17075601）
乙醇（Merk，目录号：1.00983.1011）
牛血清白蛋白（BSA）（Bio Basic，目录号：AD0023）
达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）（Lonza，目录号：12-604F）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：16000044）
抗生素 - 抗真菌药（赛默飞世尔科技（Thermo Fisher Scientific），Gibco TM，目录号：15240062）
TurboFect转染试剂（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：R0531）
蛋白质分析染料试剂浓缩物（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000006）
抗FLAG M2抗体（Sigma-Aldrich，目录号：F3165）
蛋白A / G加琼脂糖（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-2003）
腺苷5'-三磷酸（ATP）[γ-32 P]（PerkinElmer，目录号：NEG502A）
LB肉汤高盐（Duchefa Biochemie，目录号：L1704）
微琼脂（Duchefa Biochemie，目录号：M1002）
氨苄青霉素（Duchefa Biochemie，目录号：A0104）
胰蛋白胨（Duchefa Biochemie，目录号：T1332）
酵母提取物（Duchefa Biochemie，目录编号：Y1333）
氯化钠（NaCl）（Duchefa Biochemie，目录号：S0520）
氯化钾（KCl）（Duchefa Biochemie，目录号：P0515）
磷酸二氢钠二水合物（Na 2 HPO 4•2H 2 O）（Duchefa Biochemie，目录号：S0537）
磷酸二氢钾（K 2 HPO 4）（Merck，目录号：105108）
Tris（Duchefa Biochemie，目录号：T1501）
NP-40（IGEPAL CA-630）（Sigma-Aldrich，目录号：I8896）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Duchefa Biochemie，目录号：E0511）
乙二醇 - 双（2-氨基乙醚） - N，N，N'，N'， - 四乙酸（EGTA）（MP Biomedicals，目录号：194823）
β-甘油磷酸酯（MP Biomedicals，目录号：195206）
氟化钠（NaF）（Sigma-Aldrich，目录号：S1504）
二硫苏糖醇（DTT）（Bio Basic，目录号：DB0058）
苯基甲基磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
亮肽素（Sigma-Aldrich，目录号：L2884）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
L-谷胱甘肽减少（Sigma-Aldrich，目录号：G4251）
甲醇（Merck，目录号：106099）
醋酸（Merck，目录号：100056）
考马斯蓝（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：20279）
HEPES（pH 7.5）（Duchefa Biochemie，目录号：H1504.0100）
氯化镁六水合物（MgCl 2•6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M2670）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Duchefa Biochemie，目录号：S1377）
甘油（Duchefa Biochemie，目录号：G1345.1000）
β-巯基乙醇（AMRESCO，目录号：0482）
溴酚蓝（BPB）（AMRESCO，目录号：0449）
原钒酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S6508）
溶菌酶（安捷伦科技公司，产品目录号：EC 3.2.1.17）
LB培养基（见食谱）
LB琼脂平板（见食谱）
2x YTA中（见食谱）
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
细胞溶解缓冲液A（见食谱）
细胞溶解缓冲液B（见食谱）
洗脱缓冲液（见食谱）
考马斯蓝染色缓冲液（见食谱）
10倍激酶缓冲液（见食谱）
4倍SDS加载染料（见食谱）
去沉淀缓冲液（见食谱）

设备

摇动培养箱（VISION SCIENTIFIC，型号：VS-8480SF）
锥形瓶（Corning，PYREX®，目录号：4980-500）
紫外分光光度计（Mecasys，Optizen，型号：2120UV）
离心50/250毫升管
50ml离心管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：3119）
250ml离心瓶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：3120）
超声波仪（Sonics＆amp; Materials，型号：VCX 500）
高速冷冻微量离心机（TOMY DIGITAL BIOLOGY，型号：MX-300）
水包裹CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，型号：Forma Series II 3111）
移液器（Gilson，型号：PIPETMAN®，，产品目录号：F167300）
微型离心机转子架（TOMY DIGITAL BIOLOGY，型号：AR015-24）
微型离心机转子架（TOMY DIGITAL BIOLOGY，型号：AR015-24）
电泳装置（Bio-Rad Laboratories，型号：1658033FC）
平板扫描仪（爱普生，型号：爱普生Perfection V37）
凝胶干燥设备（Vision Scientific，型号：ME-2B-S）
-80°C冰柜（NuAire，型号：NU-6625D36）
水浴（VISION SCIENTIFIC，型号：VS-1205SW1）
热摇床（BIOAND，型号：MSC100）
实心锥形微尖端（Sonics＆amp; Materials，目录号：630-0418）

程序

GST融合蛋白的纯化
1. 将感兴趣的基因克隆到pGEX载体多克隆位点。
2. 将pGEX-YAP质粒（Moon等人，2017）转化到BL21细菌中，然后在含有氨苄青霉素的LB平板上生长过夜（参见食谱）。
  注意：将目的基因与GST一致克隆到pGEX载体的多克隆位点后，可以将纯化方案应用于其他GST融合蛋白。
3. 挑取一个菌落，并在14ml圆底试管（加氨苄青霉素;300μg/ 6ml 2x YTA培养基，参见食谱）中用6ml 2x YTA培养基在振荡培养箱（180rpm）中于37℃培养过夜。
4. 将所有培养的细胞转移到锥形瓶中。
5. 在37℃，振荡培养箱（180转每分钟）中用100ml 2×YTA（加入氨苄青霉素; 5mg / 100ml 2×YTA培养基）和50μMZnCl 2孵育1小时。 br />
6. 通过紫外分光光度计测量600nm（OD 600）的光密度（OD应该在0.5和0.8之间）。
  小于0.5，孵化至超过0.5。
7. 为了诱导蛋白质表达，加入1ml 100mM IPTG以使最终浓度为1mM，并在37℃下在摇动培养箱中温育2小时。
  注意：在无菌水中准备100mM IPTG原液;存放在-20°C。
8. 在3,500 xg g离心10分钟在4°C和去除上清液。
9. 加入4毫升冰冷裂解缓冲液A（见食谱），并通过上下移液重悬细菌沉淀，然后在4℃孵育10分钟。
10. 将细菌悬浮液转移到15ml锥形管中，加入1mg溶菌酶，然后在4℃孵育20分钟。
11. 在冰上40％的输出超声10秒（超声0.5秒/中断1秒），冰上30秒。再次重复超声波步骤。
12. 将溶胞产物转移至四个新的1.5ml微量离心管（等分试样1ml）中，然后在4℃以14,000xg离心10分钟。
注意：今后，在微量离心管中进行所有操作。
1. 转移上清到四个新的1.5毫升微型离心管。
2. 添加30μLPBS洗过的50％谷胱甘肽琼脂糖4B浆液（见注释），然后孵化，同时在4°C旋转90分钟。
  注意：为了去除储存液，加入1 ml冰冷的PBS洗125μl原始的谷胱甘肽琼脂糖4B浆液（储存在20％乙醇中）。在4℃以500×g离心5分钟并弃去上清液。为了获得50％的谷胱甘肽琼脂糖4B浆液，将沉淀重悬于100μl1x PBS中。
3. 在4℃500×g离心5分钟，弃去上清液。
4. 加入1 ml裂解缓冲液A（见食谱），然后在4℃下旋转10分钟进行孵育。
5. 在4℃500×g离心5分钟，弃去上清液。
6. 通过加入1ml 50mM Tris（pH8.0）进行洗涤并立即在4℃以500gxg离心5分钟。
7. 丢弃上清。
8. 添加350μL的洗脱缓冲液（见食谱）谷胱甘肽琼脂糖4B珠和孵化，同时旋转4小时或在4°C过夜。
9. 在500℃下离心5分钟5分钟，并将上清液分成20μl等分试样，并将蛋白等分试样储存在-80℃以备将来使用。
10. 为了定量纯化的重组GST-YAP的量，在10％SDS-PAGE上用BSA标准品运行等分的纯化蛋白质。为此，加入5μl4x SDS上样染料（见食谱）至15μl样品并煮沸5分钟。
  注意：将1x SDS上样染料加入到其他SDS-PAGE样品中，例如分子量标记和BSA标准，以获得20μl的总体积。
11. 在10％SDS-PAGE上分离20μlSDS-PAGE样品
12. 运行凝胶进行考马斯蓝染色，然后在摇床上的考马斯蓝染色缓冲液中室温孵育20分钟，然后用脱色缓冲液洗5次，每次10分钟。
  注意：用BSA标准品通过考马斯蓝染色来定量蛋白质的终浓度和大小（见图1和配方）。
13. 将等分试样储存在-80°C冰箱中备用。
  
  图1.纯化的GST-YAP的考马斯蓝染色的凝胶GST-YAP在凝胶中显示为95kDa的条带，单独的GST以25kDa的分子量运行，66kDa的BSA 。泳道M：蛋白质大小标记;泳道1,3,5：GST-YAP;泳道2,4：GST;泳道6：洗脱缓冲液;泳道7：BSA（1微克）。
在体外 NLK激酶测定
1. 在补充有10％FBS和1x抗生素的DMEM中的湿润的5％CO 2培养箱中37°C孵育HEK293细胞。
2. 在两个60mm的未处理的细胞培养皿中播种0.8×10 6个HEK293细胞。
3. 24小时后，根据制造商的方案（3μg）使用3μgFlag-NLK-WT（野生型）或Flag-NLK-KM（激酶阴性）质粒（Ishitani等人，1999）转染细胞TurboFect转染试剂）。
  注：DNA（μg）与TurboFect（μl）的比例为1：2至1：3。
4. 用1ml冰冷的1x PBS洗涤细胞一次（参见食谱），通过在冰冷的1ml 1x PBS中刮下细胞收获细胞，将细胞转移到微量离心管中并以14,000xg /在4°C 5分钟。
5. 弃去上清液，加入200μl裂解缓冲液B（见食谱）到沉淀。
6. 用200μl移液管上下移液约40次，溶解细胞，在4℃孵育30分钟。
7. 在14,000×g离心5分钟，并将上清液转移到新的微量离心管中。
8. 使用蛋白质分析染料试剂盒使用紫外分光光度计测量蛋白质浓度。
9. 在800μl裂解缓冲液B中用400μl转染蛋白上的抗FLAG抗体（0.5μg）在4℃孵育过夜。
10. 添加蛋白A / G加琼脂糖（每个样品20μl）。
11. 在微型离心管转子上4℃孵育120分钟
12. 在4℃3000×g离心2分钟，弃去上清液。
13. 加入800μl的裂解缓冲液B（见食谱），并在4℃下旋转孵育5分钟。
14. 在4℃3000×g离心2分钟并弃去上清液（重复步骤B12-B13三次）。
15. 加入并轻轻混合800μl冰冷的1x激酶缓冲液（参见食谱），立即在4℃下以3,000gxg离心2分钟。
16. 弃去上清，加入3μl10x激酶缓冲液，1μgGST-YAP（参见“纯化GST融合蛋白”一节），10μCi腺苷5'-三磷酸（ATP）[γ- （Flag-NLK-WT / -KM），并加入H 2 O使总体积达到30μl（Flag-NLK-WT / -KM）。
  注：放射性同位素只能由授权人员在授权的地方使用。
17. 在25°C孵育5分钟
18. 停止反应，加入10微升4倍SDS加载染料（见食谱）并煮沸5分钟。
19. 在4℃3000×g离心2分钟，小心取30μl上清液，在10％SDS-PAGE上分离蛋白质。
20. 从电泳仪上分离SDS-PAGE凝胶
21. 在室温下用考马斯蓝染色缓冲液（见食谱）在摇杆上孵育凝胶30分钟。
22. 弃去染色缓冲液，用去污缓冲液冲洗20分钟（见食谱）。
  注意：重复脱色直到背景几乎清晰。
23. 使用平板扫描仪捕获SDS-PAGE凝胶图像进行考马斯蓝染色
24. 在凝胶干燥器中干燥SDS-PAGE凝胶60分钟。
25. 在黑暗的房间里用X光胶片暗箱放射X线胶片放射30分钟到4小时。
26. 开发和修复X射线胶片分析NLK激酶活性（见数据分析）。
  
  图2.凝胶暴露的示意图

数据分析

我们已经通过用来自用Flag-NLK转染的HEK293细胞的裂解物孵育GST-YAP与免疫沉淀的Flag-NLK构建体（野生型或激酶阴性）来进行体外激酶测定。 Flag-NLK-WT检测到放射自显影的水平，但Flag-NLK-KM不明显（图3，红框）。体外 NLK激酶分析表明NLK与YAP相互作用并直接磷酸化YAP。请注意，图像分析软件（ ImageJ ）可用于量化放射摄影的强度。为此，我们比较了磷酸化的GST-YAP（放射自显影）与GST-YAP（考马斯蓝染色）总量的标准化带的强度。

图3. NLK体外磷酸化YAP 用指定的质粒瞬时转染HEK293细胞。用抗Flag抗体免疫沉淀细胞裂解物，并进行体外激酶测定。放射自显影显示GST-YAP的磷酸化和NLK的自磷酸化（上图）。通过考马斯亮蓝染色可见相似水平的GST-YAP和Flag-NLK（下图）。这个数字已经从Moon et。（2017）进行了修改。 EMBO Rep。doi：10.15252 / embr.201642683

食谱

LB培养基（高压灭菌，4°C储存）
25克/升LB肉汤高盐
LB琼脂平板（4°C储存）
25克/升LB肉汤高盐
15克/升微型琼脂
高压灭菌器倒入板中。在无菌的地方冷静下来
2x YTA培养基（高压灭菌，4°C储存）
16克/升胰蛋白胨
10克/升酵母提取物
5克/升NaCl
调整pH值到7.0
1x磷酸盐缓冲液（PBS）（高压灭菌，4°C储存）
8克/升NaCl
0.2克/升KCl
1.46 g / L Na 2 HPO 4 4 0.24g / L KH 2 PO 4 4 调整pH值到7.4
细胞裂解缓冲液A（在-20°C储存）
50 mM Tris（pH 7.5）
150 mM NaCl
0.05％NP-40（IGEPAL CA-630）
细胞裂解缓冲液B（每天新鲜制备，储存在4°C）
20 mM Tris（pH 7.5）
100 mM NaCl
1 mM EDTA
2 mM EGTA
50毫克β-甘油磷酸酯
50 mM NaF
1 mM钒酸钠
2 mM二硫苏糖醇（DTT）
1毫米苯甲基磺酰氟（PMSF）
1μg/ ml亮肽素
1％Triton X-100
洗脱缓冲液（每日新鲜）
50 mM Tris（pH 8.0）
6.8毫克/毫升还原型谷胱甘肽
考马斯蓝染色缓冲液（保存在RT）
450毫升/升甲醇
100毫升/升乙酸
2.5克/升考马斯蓝
10倍激酶缓冲液（在-20°C储存）
100毫米HEPES（pH 7.5）
10 mM二硫苏糖醇（DTT）
50mM MgCl 2 2/2
4倍SDS加载染料（在-20°C储存）
200 mM Tris（pH 6.8）
5％SDS
25％甘油
200 mMβ-巯基乙醇
0.4％溴酚蓝（BPB）
暂存缓冲区（在RT存储）
450毫升/升甲醇
100毫升/升乙酸

致谢

该协议是根据Moon等人的研究文章改编的。 FLAG-NLK构建体由日本九州大学的Ishitani T博士提供。这项工作得到了韩国国家研究基金会（2016R1E1A1A01943544）对E.Jho的支持。没有可能影响其协议设计和实施的利益冲突或利益冲突。

参考

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Kim，S.，Kim，Y.，Lee，J。和Chung，J。（2010）。 TAK1-Nemo样激酶途径对FOXO1的调节 J Biol Chem 285（11）：8122-8129。
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