材料和试剂

100毫米培养皿（康宁，目录号：430293）
15毫升管（康宁，目录号：430052）
30 G钝针（BD，目录号：305106）
棉签（VWR，目录号：89031-270）
玻璃盖玻片（Fisher Scientific，目录号：12-550-15）
尿布（VWR，目录号：82020-845）
外科口罩（VWR，目录号：10843-149）
制造商：KCWW，Kimberly-Clark，目录号：47500。
手套（VWR，目录号：82026-426）
头罩（3M，产品目录号：S-133S-5）
1毫升注射器（BD，目录号：309628）
27 G针（BD，目录号：305109）
200-μl吸头（USA Scientific，目录号：1111-1700）
无胸腺裸鼠（THE JACKSON LABORATORY，目录号：002019）
人类UM细胞系OCM1（由芝加哥伊利诺伊大学的Klara Valyi-Nagy博士提供）
0.25％胰蛋白酶（Mediatech，目录号：20-053-Cl）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Mediatech，目录号：21-040-CV）
散瞳眼药水是盐酸去氧肾上腺素眼用溶液（Paragon，NDC 42702-102-15）和托卡罗胺眼用溶液（Bausch＆amp; Lomb，NDC 24208-585-64）的混合物，比例为1：1。
羟丙甲纤维素眼用缓和溶液（Akorn， NDC 17478-064-12 ）
GONAK润滑剂（2.5％羟丙甲纤维素眼用缓冲溶液）（Akorn， NDC 17478-064 -12 ）
聚维酮碘溶液（Dynarex，NDC 67777-100-03）
盐酸氯胺酮（Hospira，NDC 0409-2053-10）
甲苯噻嗪无菌溶液（Akorn，AnaSed ， NDC 59399- 110-20 ）
新霉素和多粘菌素B硫酸盐和地塞米松眼膏（Fera，NDC 48102-003-35）
美洛昔康（Henry Schein，NDC 11695-6925-2）
10％中性缓冲福尔马林（Sigma-Aldrich，目录号：F5554-4L）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：459836-1L）
达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）（Mediatech，目录号：10-013-CV）
胎牛血清（FBS）（GE Healthcare，Hyclone TM，目录号：SH30070.03HI）。
青霉素 - 链霉素溶液（Mediatech，目录号：30-002-Cl）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D5879-500ML）
细胞培养基（见食谱）
细胞冷冻保存液（见食谱）

设备

细胞培养孵育器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Series 8000 Water-Jacketed，目录号：3423）
台式离心机（Fisher Scientific，型号：accuSpin 24C TM）
-80℃冷冻机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：TSU TM TM Series，目录号：TSU400A-EA）
5-μl注射器（汉密尔顿，目录号：87900）
50毫升烧杯（VWR，目录号：10754-946）
镊子（VWR，目录号：82027-404）
剪刀（VWR，目录号：89259-982）
200μl移液器（Eppendorf，目录号：3123000055）
液氮罐（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：CY50945）
手术显微镜（奥林巴斯，型号：SZ61 / 51）
暖垫（Pristech Products，目录编号：20414）
高压灭菌器（SOMA Technology，型号：Steris Amsco Century V116）
-20°C冰柜（Kelvinator商业，型号：KCBM180FQY）
无菌罩（Labconco，型号：II级，B2型（全部排气））

程序

注：无性生殖的裸鼠购自杰克逊实验室，育种，饲养和手术程序符合视觉和眼科学研究协会（ARVO）在眼科和视力研究中使用动物的声明，由中南大学或路易斯维尔大学动物管理与使用委员会（IACUC）批准。

UM细胞的制备
1. 芝加哥伊利诺斯大学的Klara Valyi-Nagy博士慷慨提供了人类UM细胞系OCM1。
2. 将该OCM1细胞在含有10％热灭活的胎牛血清[FBS]，100U / ml青霉素和0.1mg / ml链霉素的Dulbecco改良伊格尔培养基[DMEM]的培养基（参见食谱）中于37℃培养， 5％CO 2培养箱。
3. 细胞以1：3的比例进行传代，通过用足够的0.25％胰蛋白酶溶液进行胰蛋白酶消化以除去培养基后覆盖细胞培养皿表面，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗细胞两次。
4. 加入培养基使胰蛋白酶失活。
  加入比上面使用的胰蛋白酶溶液多两倍的培养基
5. 将胰蛋白酶消化的细胞转移至15ml管中，在500℃下在500rpm下离心5分钟，并重悬于PBS中以使终浓度为5×10 4 /细胞/μl。
6. 如果不立即使用，细胞可以以1×10 6个细胞/ ml的浓度重新悬浮在冷冻保存培养基（含有10％二甲基亚砜的上述培养基，参见食谱）中，然后保存在用于短期储存（<1个月）的-80℃冷冻机或用于长期储存（> 1个月）的液氮罐中。
仪器灭菌
1. 准备一个30 G钝针和一个5微升的注射器，将它们放入一个50毫升烧杯与30毫升蒸馏水煮沸30分钟。
2. 准备钳子和剪刀，用流水清洗仪器5分钟，用标准程序（121℃20分钟）对高压灭菌器中的所有仪器进行消毒。
3. 准备棉签，30 G针，散瞳滴眼液，聚维酮碘和红霉素眼膏，玻璃盖玻片。
4. 将无菌尿布置于手术显微镜或任何双目镜下，建立并保持无菌区域，以尽量减少可能的污染。
5. 在操作前，操作人员应戴头罩，面罩和消毒手套
麻醉的准备和动物的定位
1. 准备6周龄的无胸腺裸鼠，分别称量所有小鼠，以确保每个小鼠的准确药物剂量。
2. 用27G针头和1毫升注射器腹腔（IP）麻醉注射，注射器中含有每公斤体重100毫克氯胺酮和10毫克甲苯噻嗪的混合物。
3. 监测麻醉的有效性，直到动物完全堕入睡眠状态，然后再进行手术。
4. 给一滴散瞳药滴眼液来扩张瞳孔。
5. 用一把剪刀修剪眼睫毛（刀片上有一些眼药膏）。
6. 给2滴聚维酮碘消毒眼睛。
7. 给一滴眼睛润滑剂滴眼睛湿润。
8. 将动物放在尿布上，让它躺在一边，以方便手术。
玻璃体内注射肿瘤细胞（见视频1）
1. 将消毒的玻璃盖玻片放在眼球上，使手术显微镜聚焦清晰。
2. 使用30G针在角膜缘后约1毫米处戳一个孔
3. 在注射之前，使用200-μl吸头上下移动以确保单细胞悬液。
4. 使用汉密尔顿微量注射器将2μl上述制备的细胞注射到玻璃体中，并将针头放在后面以避免接触镜片以避免白内障形成。
5. 在切口处按棉签1分钟，用红霉素软膏覆盖眼睛，以防止注射后出血。
6. 注射2μl的PBS以相同的方式进入另一只眼睛作为羞耻的控制。
手术后的动物护理
1. 保持移植的老鼠在温暖的垫上，检查他们的呼吸和活动每小时，直到他们恢复。
2. 保持小鼠处于无特定病原体状态，照常保持温暖，通风和清洁笼子。
3. 检查伤口，并在接下来的5天内每天（在麻醉状态下）加入软膏以防止感染。
4. 给予每毫升0.25毫克皮下注射5毫克/毫升美洛昔康0.1毫克至少2天，以减轻伤口疼痛。
肿瘤生长评估
1. 准备1毫升注射器和27克针头，每公斤体重含有100毫克氯胺酮和10毫克赛拉嗪的混合物腹腔麻醉。
2. 使用一滴散瞳药滴眼液来扩张瞳孔。
3. 把动物放在一边。
4. 给一滴眼药水，并在眼球上放一个玻璃盖玻片。
5. 将动物置于手术显微镜下或用间接检眼镜检查眼底。估计肿瘤大小与整个玻璃体腔相关。
潜在的转移评估
1. 4周后通过CO 2吸入使颈椎脱臼安乐死小鼠。
2. 用石蜡包埋切片分离眼，肝，肺和肾，通过组织学的血吸虫和曙红（H＆amp; E）染色来检查原发肿瘤和转移的形成。
肿瘤解剖和组织学
1. 将所有收集的组织放入10％中性缓冲的福尔马林中，然后加入70％乙醇中，直至进一步处理以包埋在石蜡中。
2. 切片10微米的组织进行组织病理学和免疫染色分析。

数据分析

代表结果
对16只裸鼠的上述程序导致眼睛（87.5％）和肝脏（50％）两者形成肿瘤。检眼镜下或眼外发现肿瘤的平均时间分别为12.4天和23.8天（图1A-1C）。肿瘤在眼睛外生长一周后使小鼠安乐死。尽管视网膜结构仍保持相对完整（图2A），但眼外肿瘤通常伴有出血和眼萎缩（图1C和2A）。在血管周围的肝组织中检测到微转移（图2B）（Chen等人，2017）。

图1.裸鼠肿瘤生长的时间过程A.眼睛内外的肿瘤发展; B.玻璃体内注射肿瘤细胞12天后; C.玻璃体内注射肿瘤细胞25天后。 PID，注射后一天。

图2.眼睛和肝脏中肿瘤的苏木精和伊红（H＆amp; E）染色。：一种。眼中的异种移植肿瘤; B.肝脏中的肿瘤微转移。 T，肿瘤。 R，视网膜。 LC，肝细胞。 MetT，肿瘤转移。 BV，血管。
讨论
1. 该协议描述了在裸鼠中的异种移植肿瘤模型以使得能够研究UM肝转移。裸鼠通常用于肿瘤研究，因为它们是免疫缺陷的。与其他小鼠如C57BL / 6相比，异种移植肿瘤在裸鼠中快速生成，其中我们没有观察到通过OCM1细胞玻璃体内注射的任何眼内肿瘤形成（数据未显示）。与遗传和化学诱导的UM模型（其中转移性肿瘤很少产生或者转移仅在其它器官如肺中而不在肝中发生）相反，所描述的异种移植UM模型是简单的并且有效地在相对较短的时间内产生肝转移。还有其他方法使用皮肤黑素瘤细胞进行异种移植肿瘤研究;然而，通常在肺中检测到转移病灶（Kilian等人，2016）。人类UM细胞异种移植肿瘤模型在生物学和病理学特征方面表现出与人类UM发展更为相似。该协议的关键步骤是玻璃体内注射。小鼠具有成本效益，易于护理和实验操作。然而，与其他流行的动物模型相比，它们的镜片非常大，几乎占据了玻璃体的90％，而小鼠的玻璃体腔相对较小。因此，植入的UM细胞的数量是有限的，并且镜片的偶然接触会产生白内障，这阻碍了对随访肿瘤生长的观察。将针头向后指向视网膜可避免接触镜头。 UM异种移植模型包括前房或UM皮下注射UM肿瘤细胞（de Lange等人，2012; Kilian等人，2016），但玻璃体内注射肿瘤细胞可能对眼后段有更多的影响，这将模仿大多数人类UMs发展的背景。虽然脉络膜黑色素瘤的最佳选择是次级RPE注射，但是技术上更难以理解误入视网膜下腔或穿孔巩膜的风险，因此会显着降低成功率。
2. 当肿瘤生长在眼外时，在该模型中检测到肝脏微转移。然而，在肺，肾和脾中未发现类似的微转移，这可能是由于短期的观察。实际上，有些裸鼠在肿瘤生长的时候死亡，死亡的原因可能是由于眼外肿瘤坏死引起的出血或感染。所描述的UM肝转移小鼠模型可用于评价UM的全身治疗，这将为预防UM的转移提供新的前景。

笔记

直接将活细胞通过小瓶中的冷冻保存介质置于液氮中导致大量细胞死亡。因此，通过将细胞首先放置在-20℃的冷冻器中一天，然后在-80℃的冷冻器中保存一天，然后将它们储存在液氮中，从而显着地保持了细胞在其长期冷冻保存中的活力。
必须在无菌条件下进行玻璃体内注射以避免眼部感染。无菌技术包括使用局部消毒剂，无菌盖玻片，手套和外科手术。所有细胞培养相关的解决方案和塑料制品必须是无菌的，操作必须在无菌罩中进行。
使用赛拉嗪 - 氯胺酮混合物进行麻醉可能引起急性和可逆性白内障，影响随后的玻璃体内注射肿瘤细胞。为了避免这样的问题，操作者可以通过以适当的剂量IP注射替代药物如阿佛丁来麻醉小鼠（即，使用350μl用于20-g小鼠）。
鼠标透镜比较大，而小鼠玻璃体腔则非常小。不小心通过玻璃体内注射针头接触晶状体会导致白内障，妨碍随后的眼部肿瘤形成的观察。因此必须注意避免将针头向后指向视网膜，并将细胞从注射器中轻轻推入玻璃体内，以免触及镜片。

食谱

细胞培养基
Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），含10％热失活胎牛血清（FBS），含100U / ml青霉素和0.1mg / ml链霉素
细胞低温保存培养基
达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）与10％热灭活胎牛血清（FBS）与10％二甲基亚砜（二甲基亚砜）

致谢

我们感谢Drs。芝加哥伊利诺伊大学的Klara Valyi-Nagy和Tibor Valyi-Nagy为我们提供了OCM1人类UM细胞系。本研究由国家自然科学基金（No.3087282和81072221）和湖南省自然科学基金（14JJ2005）和路易斯维尔医学院基础研究基金（E0819〜YL）资助，，以及防止盲目性的研究（在路易斯维尔的DOVS），并部分刊登在“科学报告”（Chen等人，2017年）中。作者没有什么可以披露的。

参考

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