材料和试剂

过滤移液枪头
6孔板（Corning，目录号：3516）
冰桶
铝箔
1.5ml微量离心管（Corning，Axygen，目录号：MCT-150-C）
Whatman TM 3030-347 Grade 3 MM Chr纤维素层析纸（GE Healthcare，目录号：3030-347）
Minisart过滤孔径0.22μm（Sartorius，目录号：16534-K）
（ATCC，目录号：CCL-2）
10x PBS（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM9624）
青霉素 - 链霉素溶液（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15070063）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：12657029）
Dulbecco改良的Eagle's中高葡萄糖 - 不含L-甲硫氨酸，L-半胱氨酸和L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：D0422）
L-甲硫氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：M9625）
L-半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：168149）
L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25030081）
EasyTag TM 35 SL蛋氨酸和35 SL-半胱氨酸（Express蛋白质）的35S蛋白质标记混合物标签）（PerkinElmer，目录号：NEG772007MC）
Trizma base（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15575020）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P8340）
蛋白A加上Ultralink树脂（Thermo Fisher Scientific，目录号：53142）
10％（v / v）牛血清白蛋白（BSA）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15561020）
组织蛋白酶D抗体（EMD Millipore，Calbiochem，目录号：219361）
L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25030149）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
甘油（C 3 H 8 O 3）（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B0126）
甲醇（CH 3 OH）（Sigma-Aldrich，目录号：322415）
乙酸（CH 3 -COOH）（Sigma-Aldrich，目录号：320099）
放大荧光试剂（GE Healthcare，目录号：NAMP100）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3701）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：12800017）（参见食谱）
100倍的L-蛋氨酸/ L-半胱氨酸溶液（见食谱）
脉冲媒介（见食谱）
追逐中等（见食谱）
裂解缓冲液（见食谱）
清洗缓冲液（见食谱）
2x样品缓冲液（见食谱）
固定解决方案（见食谱）
运行缓冲区（见食谱）

设备

移液器
孵化器
滴定板摇床（Thermo Fisher Scientific，目录号：4625Q）
用微型离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：75003652）的转子离心1.5ml微型离心管（Thermo Fisher Scientific，型号：Sorvall TM ST16，目录号：75004380） br />
管旋转器能够管端倒置（Phoenix Luferco，产品目录号：AP22或同类产品）
运行微型凝胶的室（Bio-Rad Laboratories，型号：Mini-PROTEAN Tetra Cell）
凝胶干燥机（Hoefer，型号：GD2000，板式凝胶干燥机）与真空泵配套使用
用于未安装屏幕的曝光盒，20 x 25厘米（GE Healthcare，目录号：63-0035-44）
Pharos FX plus分子成像仪（Bio-Rad Laboratories，目录号：1709450）
BAS存储荧光屏（GE Healthcare，目录号：28-9564-82）
适当处理被35S污染的固体和液体的容器（根据当地的辐射安全指南）

软件

Quantity One一维分析软件（Bio-Rad Laboratories）

程序

放射性脉冲追踪
1. 在2ml完全DMEM中板/ 5×10 5 HeLa CCL-2细胞/孔（6孔板），孵育24小时/ 37℃/ 5％CO 2 / （图1）。每个时间点或条件使用一个井。
2. 倾斜板和吸取介质，用1毫升预热（室温）PBS洗两次细胞。
3. 用700μl预热（37℃）的脉冲培养基（-Cys / -Met;补充有10μl/ ml 100x L-谷氨酰胺，参见食谱）孵育细胞30分钟/ 37℃/ 5％CO _{2 。请记得检查您当地的辐射安全指南。从这个步骤开始，废物必须根据您当地的安全指南单独收集和丢弃。}
4. 将板转移到覆盖着铝箔的冰桶。
5. 去除培养基，加入700μl/孔冰冷的脉冲培养基（+ Cys 35 S / + Met 35S）。
6. 孵育15分钟/ 37℃/ 5％CO 2。
  脉冲的时间长短取决于catD生物合成的速率，其可以根据细胞系而变化。对于HeLa细胞，15分钟/ 37°C就足够了。对于其他细胞系，用户可能必须优化脉冲的时间。
7. 将板转移到覆盖着铝箔的冰桶。
8. 倾斜板和吸取介质，用1毫升冰冷PBS洗两次细胞。
9. 加入800μl预热（37℃）追逐培养基（见食谱）。
10. 将细胞孵育5小时/ 37℃/ 5％CO 2。
11. 将板转移到覆盖着铝箔的冰桶。
12. 将培养基（以下称为“培养基”样品）转移到微量离心管中，并放置在冰上。
13. 用1毫升冰冷的PBS洗细胞两次。
14. 取出PBS并加入800μl冰冷的裂解缓冲液/孔（在使用前肉汁补充1：100蛋白酶抑制剂混合物，参见食谱）。
15. 将平板转移到冰桶中，在滴定板摇床上温和搅拌下孵育15分钟。
16. 15分钟后温育，使用微量移液管尖端将细胞裂解液（以下称为“细胞裂解液”样品）轻轻均质化并将裂解液转移到微量离心管中。
17. 将样品（细胞裂解物或培养基，参见步骤A12和A16）在18,000×g（4℃，14000×gg）下离心20分钟。 />
18. 将等体积的澄清上清液（约750μl）从管中（澄清的细胞裂解液或培养基样品）转移到新的微量离心管中，将它们放在冰上并丢弃颗粒。
  1. 沉淀物质进入免疫沉淀步骤可能会导致非特异性的高背景。
  2. 如有必要，可将澄清的细胞裂解液和培养基样品冷冻于-80°C直到用于免疫沉淀。然而，优选收获细胞（来自步骤A13）并冷冻细胞沉淀而不是细胞裂解物（步骤A17）以避免蛋白质降解。
    
    图1.图示组织蛋白酶D的代谢标记和脉冲追踪分析的示意图概述
免疫沉淀
1. 用500μl冰冷的PBS通过在3000xg离心1分钟将珠子（30μl的50％蛋白-A Ultralink树脂/含水浆液每个追赶时间/条件点）洗涤3次， 4°C（图1）。该步骤除去含有0.02％叠氮化钠的含水浆液，其可能干扰抗体结合。确保在试管中留下初始体积的珠粒/浆液（每个追踪时间/条件点约30μl）。
  1. 对于大量珠子（超过500μl），可以使用15ml锥形聚苯乙烯离心管，并且用至少1：3体积的珠子浆液/ PBS进行洗涤。
  2. 。为了补偿洗涤和移液过程中的损失，开始使用大约10-20％额外量的珠子是很重要的
2. 洗涤后，重悬在500μl含有5μl10％（v / v）BSA和2μl组织蛋白酶D抗体的冰冷的PBS中的30μl珠（在50％PBS浆液中）。彻底混合悬浮液。
  当处理多个样品时，建议制备珠/抗体“主混合物”。这是通过按照样品数量的比例增加上述数量，并将悬浮液在15ml锥形聚苯乙烯离心管中孵育来完成的。
3. 在管旋转器上缓慢旋转下孵育2-3小时/ 4℃（能够颠倒颠倒）。在这个步骤中，抗体会结合珠子。
4. 通过在4℃下3000g离心1分钟使珠粒团，并除去上清液。
5. 用1ml冰冷的裂解缓冲液重复步骤B4洗珠3次。
6. 在最后的洗涤步骤后，离心含有珠子的管并除去上清液，确保在试管中保留初始体积的珠/浆液（每个追踪时间/条件点约30μl）。
7. 对于每个免疫沉淀样品，在微量离心管中孵育：30μl珠/抗体（50％PBS浆液），750μl澄清的细胞裂解物或培养基，样品，10μl10％BSA和200μl裂解缓冲液（补充有1：100蛋白酶抑制剂鸡尾酒）。
8. 在缓慢旋转下在管子旋转器上孵育2-3小时/ 4℃
9. 孵育步骤后，离心管，取出上清液，并用1毫升洗涤缓冲液（参见食谱）洗涤珠子3次，最后用1毫升1x PBS洗一次。
10. 从微量离心管中取出所有的PBS，并重新悬浮在20μL的2x样品缓冲液（见食谱）的珠子。此时，样品可以保存在-80°C。
SDS-PAGE和荧光成像
1. 将样品煮沸5分钟/ 95°C。
2. 旋转管并将上清液加载到SDS-PAGE微型凝胶（10％; 1mm凝胶）上。在这里，您还可以在凝胶上加载分子量标准。
3. 在恒定的120V电泳缓冲液中运行约2小时的电泳（见食谱）。请注意，运行条件和时间会根据使用的电泳系统而有所不同。
4. 在一个干净的塑料容器中，在室温下用25ml /凝胶固定溶液（见食谱）固定凝胶30分钟，
5. 去除固定溶液，并在室温下在具有缓慢旋转的滴定板振荡器上用25ml /凝胶放大荧光试剂孵育凝胶30分钟。
6. 在凝胶干燥器上将凝胶干燥到层析纸上45分钟/ 80℃。用保鲜膜覆盖凝胶，以避免粘在凝胶干燥器盖上。
  。凝胶必须完全脱水（不再有粘性），在80℃45分钟就足够了。
7. 将BAS存储荧光屏暴露在暴露盒中的干燥凝胶上，在室温下通常保持1周，避光。理想的曝光时间将取决于标记的猫的数量。
8. 使用Pharos FX plus分子成像仪或同等产品扫描屏幕，并使用Quantity One一维分析软件（Bio-Rad Laboratories）分析结果。

数据分析

在显示筛选后，图像应该显示指示前体组织蛋白酶D（pro-catD，〜52kDa），中间体形式（int-catD，〜48kDa）和成熟的溶酶体形式（m-catD，〜34 kDa）和仅在培养基/上清液样品中的痕量pro-catD（图2）。请注意，这些分子量在不同细胞类型中略有不同。您可以通过不同的catD物种的密度定量分析组织蛋白酶D的溶酶体分选中的改变。一种方法是比较前体和成熟形式的细胞内丰度与分泌前体的丰度，作为分泌总量与总catD的比率，或比较成熟形式的丰度与总catD作为比率（Hirst等人，2009）。每个catD物种的相对丰度也可以通过存在于相应物种中的甲硫氨酸和半胱氨酸残基的数量来标准化（Kametaka等人，2007）。您可以检查2008年Minarowska等人每种人类catD物种预测的蛋氨酸和半胱氨酸残基的数量。

图2.体内标记/脉冲追踪实验的代表性图像在6孔板中铺板24小时后，将HeLa细胞用[ 35 S]甲硫氨酸 - 半胱氨酸孵育15分钟，然后在37℃在追踪缓冲液中温育5小时。使用细胞裂解物（泳道1）和培养基（泳道2）样品用抗组织蛋白酶D抗体进行免疫沉淀，所得免疫沉淀物通过SDS-PAGE和荧光成像分析。指出pro-（pro-catD），中间（int-catD）和成熟组织蛋白酶D（m-catD）形式的位置。

食谱

补充100U青霉素/ ml和0.1mg / ml链霉素和10％（v / v）胎牛血清（FBS）的Dulbecco's改良Eagle培养基（DMEM）
100x L-蛋氨酸/ L-半胱氨酸混合溶液
1. 溶解1毫升Milli-Q水中1.5毫克的L-蛋氨酸和L-半胱氨酸
2. 用0.22μm注射器过滤器过滤消毒以保存
3. 存放在4℃的离心管中。
脉冲媒体
Dulbecco改良的Eagle's中等蛋氨酸，半胱氨酸和无谷氨酰胺补充：
2mM L-谷氨酰胺
0.1mCi / ml的35S-蛋氨酸半胱氨酸
追逐中等
补充10μl/ ml 100x L-蛋氨酸/ L-半胱氨酸混合溶液的完全DMEM（方案1）
裂解缓冲液（4°C储存）
50 mM Tris-HCl（pH 7.4）
300 mM NaCl
5mM EDTA pH 8
0.5％（v / v）Triton X-100
清洗缓冲液（在4°C储存）
50 mM Tris-HCl（pH 7.4）
300 mM NaCl
5mM EDTA pH 8
0.1％（v / v）Triton X-100
2x样本缓冲区
20毫升10％（v / v）SDS
16毫升的0.5M Tris-HCl pH 6.8
10毫升甘油
0.1％溴酚蓝
4％β-巯基乙醇
Milli-Q水
注意：该溶液可以在室温下储存，但在使用前加入新鲜的β-巯基乙醇。
固定解决方案
50％甲醇
10％醋酸
运行缓冲区
30克Tris
144克甘氨酸
10克SDS
用1毫升Milli-Q水完成

致谢

该协议已被改编自以前发表的论文（Tavares等人，2017年）。这项工作得到了圣保罗研究基金会（FAPESP）对LLPdS的资助（2014 / 25812-0）和LAT的博士奖学金（2016 / 18207-9）的支持。作者宣称没有利益冲突。

参考

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Ghosh，P.，Dahms，N.M。和Kornfeld，S。（2003）。甘露糖-6-磷酸受体：故事中的新曲折 Nat Rev Mol Cell Biol 4（3）：202-212。
Hirst，J.，Sahlender，D. A.，Choma，M.，Sinka，R.，Harbour，M.E.，Parkinson，M.and Robinson，M.S。（2009）。果蝇中的GGAs和AP-1的空间和功能关系和HeLa细胞。 Traffic 10（11）：1696-1710。
Kametaka，S.，Moriyama，K.，Burgos，P.V.，Eisenberg，E.，Greene，L.E.，Mattera，R。和Bonifacino，J.S。（2007）。细胞周期蛋白G相关激酶与衔接蛋白1的典型相互作用调节溶酶体酶分选。
Minarowska，A.，Gacko，M.，Karwowska，A。和Minarowski，L。（2008）。人体组织蛋白酶D. Folia Histochem Cytobiol 46（1））：23-38。
Poole，A.R。，Dingle，J.T。和Barrett，A.J。（1972）。组织蛋白酶D的免疫细胞化学证明 Histochem Cytochem 20（4）：261-265。
Tavares，L.A.，da Silva，E.M.，da Silva-Januario，M.E.，Januario，Y.C.，de Cavalho，J.V.，Czernisz，E.S。，Mardones，G.A。和daSilva，L.L.（2017）。 HIV-1蛋白Nef的CD4下调揭示了AP的γ1和γ2亚基的不同作用-1复合物在蛋白质运输中的作用。J Cell Sci 130（2）：429-443。