材料和试剂

免疫金标记微管和微管组织中心蛋白
1. 带铝盖的闪烁瓶（Fisher Scientific，目录号：03-340-4B）
  制造商：DWK Life Sciences，Kimble，目录号：7450320。
2. 巴斯德吸管（Fisher Scientific，目录号：13-678-20C）
3. 明胶胶囊（电子显微镜科学，目录号：70100）
4. 200目镍网（Electron Microscopy Sciences，目录号：EMS200-Ni）
5. 300目金网格（电子显微镜科学，目录号：EMS300-Au）
6. 玻璃培养皿（康宁，目录号：3160-101）
7. 90毫米滤纸（GE Healthcare，目录号：1004-090）＆nbsp;
8. 无菌过滤器（0.2μm）（Corning，目录号：431212）
9. Parafilm（Sigma-Aldrich，Parafilm，目录号：P7793）
10. 牙科蜡板（电子显微镜科学，目录号：72670）
11. 玻璃载玻片（Fisher Scientific，目录号：12-544-1）
12. 微量离心管，1.5毫升天然（美国科学，目录号：1615-5500）
13. 二氯乙烷（电子显微镜科学，目录号：13250）
14. LR白色树脂（Electron Microscopy Sciences，目录号：14383）
15. 一抗（见表1），中心蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：ABE480）; MPM-2（EMD Millipore，目录号：05-368）
  
  表1.在精子发生过程中用于免疫金标记微管，微管组织中心蛋白质和胞外基质中的碳水化合物和阿拉伯半乳聚糖蛋白质的一级抗体
  
  角叉菜（hornwort）;藓类小立碗藓（苔藓）; Aulacomnium palu stre（moss）; （蕨），和银杏（种子植物）。
16. 第二抗体：与金结合的山羊抗小鼠（Millipore Sigma，目录号：G7652）
17. Sorenson磷酸盐缓冲液，0.2M，pH7.2（Electron Microscopy Sciences，目录号：11600-10）
18. 戊二醛（电子显微镜科学，目录号：16120）
19. 四氧化锇（电子显微镜科学，目录号：19150）
20. PIPES缓冲液，0.2M，pH7.2（Sigma-Aldrich，目录号：P6757）
21. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：B4287）
22. 乙酸铀酰（Polyscience，目录号：21447）
23. 硝酸铅（电子显微镜科学，目录号：17900）
24. 柠檬酸钠（电子显微镜科学，目录号：21140）
25. 1N NaOH（Electron Microscopy Sciences，目录号：21170-01）
26. 0.01 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）（见食谱）
27. 0.05M磷酸盐缓冲液（pH7.2）（见食谱）
28. 2.5％戊二醛（见食谱）
29. 2％的四氧化锇水溶液（见食谱）
30. 0.02 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）（见食谱）
31. 抗体（见食谱）
32. 2％PBS / BSA（见食谱）
33. 0.05 M PIPES缓冲液（pH 7.2）（见食谱）
34. 2％醋酸铀（见食谱）
35. 1 N NaOH（见食谱）
36. 雷诺的铅柠檬酸盐（见食谱）
免疫金标记的精子和基质细胞壁成分
1. 带铝盖的闪烁瓶（Fisher Scientific，目录号：03-340-4B）
  制造商：DWK Life Sciences，Kimble，目录号：7450320。
2. 巴斯德吸管（Fisher Scientific，目录号：13-678-20C）
3. 200目镍网（Electron Microscopy Sciences，目录号：EMS200-Ni）
4. 300目金网格（电子显微镜科学，目录号：EMS300-Au）
5. 90毫米滤纸（GE Healthcare，目录号：1004-090）＆nbsp;
6. 牙科蜡板（电子显微镜科学，目录号：72670）
7. 玻璃培养皿（康宁，目录号：3160-101）
8. 玻璃载玻片（Fisher Scientific，目录号：12-544-1）
9. 明胶胶囊（电子显微镜科学，目录号：70100）
10. 微量离心管，1.5毫升天然（美国科学，目录号：1615-5500）
11. Parafilm（Sigma-Aldrich，Parafilm，目录号：P7793）
12. 无菌过滤器（0.2μm）（Corning，目录号：431212）
13. 二氯乙烷（电子显微镜科学，目录号：13250）
14. LR白色树脂（Electron Microscopy Sciences，目录号：14383）
15. 一抗（ PlantProbes ）（见表1）
16. 二抗：羊抗鼠IgG-金（Sigma-Aldrich，目录号：G7035）
17. 第二抗体：与金结合的山羊抗小鼠（Sigma-Aldrich，目录号：G7652）
18. 索伦森的磷酸盐缓冲液，0.2M，pH7.2（Electron Microscopy Sciences，目录号：11600-10）
19. 戊二醛（电子显微镜科学，目录号：16120）
20. 四氧化锇（电子显微镜科学，目录号：19150）
21. PIPES缓冲液，0.2M，pH7.2（Sigma-Aldrich，目录号：P6757）
22. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：B4287）
23. 乙酸铀酰（Polyscience，Inc.，目录号：21447）
24. 硝酸铅（电子显微镜科学，目录号：17900）
25. 柠檬酸钠（电子显微镜科学，目录号：21140）
26. 1N NaOH（Electron Microscopy Sciences，目录号：21170-01）
27. 0.01 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）（见食谱）
28. 0.05M磷酸盐缓冲液（pH7.2）（见食谱）
29. 2.5％戊二醛（见食谱）
30. 2％的四氧化锇水溶液（见食谱）
31. 0.02 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）（见食谱）
32. 抗体（见食谱）
33. 2％PBS / BSA（见食谱）
34. 0.05 M PIPES缓冲液（pH 7.2）（见食谱）（见食谱）
35. 2％醋酸铀（见食谱）
36. 1 N NaOH（见食谱）
37. 雷诺的铅柠檬酸盐（见食谱）

设备

免疫金标记微管和微管组织中心蛋白
1. 本生灯（Fisher Scientific，产品目录号：S12809）
2. -20°C冷冻机
3. M2100 Benchmark Tube Rocker（ Benchmark Scientific Inc. ）
4. 烤箱（一般信号，型号：重力对流）
5. 水浴（谢尔顿制造，型号：SWB23）
6. 微量移液器（Bioexpress，GeneMate，目录号：P-4963-20）
7. 离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：75004061）
8. 钻石刀（Diatome，规格：超，45°，4毫米，湿）
9. 透射电子显微镜（日立，型号：HF7100）
免疫金标记的精子和基质细胞壁成分
1. 本生灯（Fisher Scientific，产品目录号：S12809）
2. M2100 Benchmark Tube Rocker（ Benchmark Scientific Inc. ）
3. 烤箱（一般信号，型号：重力对流）
4. 微量移液器（Bioexpress，目录号：P-4963-20）
5. 离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：75004061）
6. 钻石刀（Diatome，规格：超，45°，4毫米，湿）
7. 潮湿的房间（见注）
8. 透射电子显微镜（日立，型号：HF7100）

程序

免疫金标记微管和微管组织中心蛋白（Vaughn和Bowling，2008; Vaughn，2013）
注意：对于下面描述的每种溶液变化，通过添加溶液使样品完全饱和直到覆盖样品瓶/管中的材料。
1. 在0.05M Sorenson's磷酸盐缓冲液（pH7.2）中的2.5％戊二醛中，在室温下固定小块的几个antheridia或整个配子体植物（如果小，如蕨类植物）。带铝盖的闪烁瓶是这个过程的理想选择（或者，您也可以使用1.5毫升微量离心管）。如果使用部分植物，则在一滴戊二醛溶液中切割样品。
2. 在相同的0.05M Sorenson缓冲液中洗涤2-3次，每次在4℃下15分钟。为了便于在不损失小样本的情况下交换解决方案，巴斯德移液管的尖端通过本生灯加热，使得尖端孔径降低到其原始尺寸的大约三分之一。通过这种方式，可以进行清洁的交流，以便在交换过程中，微小的样品不会被吸入移液管中并丢失。
3. 2％（v / v）锇后固定组织10分钟
4. 连续脱水：取出PIPES缓冲液，加入25％乙醇（在0.05M PIPES缓冲液中）到小瓶中，以25％的增量增加乙醇的百分比，直到达到75％乙醇。
5. 用100％乙醇交换溶液数次。这些步骤应该在4°C，并在第二次100％乙醇转移后将小瓶转移到-20°C冷冻箱中。
6. 加入LR白色树脂（伦敦树脂公司）以达到25％塑料（在乙醇中）。摇动小瓶将塑料混合到溶剂中，并保持在-20°C一天。重复此步骤，将塑料添加至50％一天，然后再将塑料添加至75％一天。交换解决方案，把100％的树脂放入小瓶中。摇动小瓶，确保样品沉入树脂中。让他们在100％树脂中度过24小时。
7. 让小瓶升温至室温，并在摇摆平台上摇动24小时。这将允许整个样品渗透树脂。
8. 将样品转移至明胶胶囊，并用100％树脂填充胶囊形成弯月面。旋转盖子插入，以创建一个不含氧气的屏蔽。放入一个50°C的烤箱中，并在〜2天后取出。
9. 修剪样品，并用钻石刀切割100纳米（浅金色反射颜色），并用二氯乙烷烟雾部分来拉伸切片。
  通过触摸300目金网格或200目镍网格的钝面来拾取部分
10. 将安装好的网格放入一个封闭的CLEAN培养皿中，室温下干燥1-2小时，或将培养皿置于载玻片加热器上（45-50°C）30分钟。
11. 浮动网格，截面侧下降10μL下列解决方案（所有这些都是通过250纳米过滤器过滤）下降和时间：
  1. 在0.02M磷酸钠缓冲液（PBS / BSA; pH 7.2）中的2％BSA，30分钟（封闭）。
  2. 在2％PBS / BSA中1:20稀释的一抗或单克隆抗体滴在室温下3-4小时。
12. 冲洗网格放置在2％BSA / PBS 4×3分钟的水滴。
13. 将网格放置在5-15μl滴加二次金标记的抗体或蛋白质A /黄金稀释的1/20-in 2％BSA / PBS'潮湿室'1-3小时。
14. 将网格移动到5-10μl的0.02 M PBS中，冲洗4 x 3-5 min（过滤和离心）。
15. 用已经过滤（0.2微米）的双蒸蒸馏水冲洗每个网格，并使其干燥。
16. 在2％乙酸铀酰中将网格染色2分钟，用双蒸压灭菌水洗涤，并在雷诺的柠檬酸铅中后期染色。在蒸馏水蒸馏水中洗涤，干燥并在透射电子显微镜下观察。
免疫金标记的精子基质和细胞壁成分（Lopez和Renzaglia，2014）
1. 在0.05M Sorenson's磷酸盐缓冲液（pH7.2）中的2.5％戊二醛中，在室温下固定小块的花药组织或整个配子体植物（如果小的话，如蕨类植物）。带铝盖的闪烁瓶是这个过程的理想选择（或者，您也可以使用1.5毫升微量离心管）。如果使用部分植物，则在一滴戊二醛溶液中切割样品。
2. 在相同的0.05M Sorenson缓冲液中洗涤2-3次，每次在4℃下15分钟。为了便于在不损失小样本的情况下交换解决方案，巴斯德移液管的尖端通过本生灯加热，使得尖端孔径降低到其原始尺寸的大约三分之一。通过这种方式，可以进行清洁的交换，以便在交换期间微小的样品不会被吸入移液管中。
3. 在1％（v / v）四氧化锇（OsO 4）中固定组织10分钟。
4. 用蒸馏水冲洗3次（每次10分钟）。
5. 连续脱水：取出水并加入25％乙醇（在水中）到小瓶中，以25％的增量增加乙醇的百分比，直到达到75％的乙醇。
6. 用100％乙醇交换溶液3次。
7. 加入LR白色树脂（伦敦树脂公司）以达到25％塑料（在乙醇中）。摇动小瓶将塑料混合到溶剂中，并保持在-20°C一天。重复此步骤，将塑料添加至50％一天，然后再将塑料添加至75％一天。交换解决方案，把100％的树脂放入小瓶中。摇动小瓶，确保样品沉入树脂中。让他们在100％树脂中度过24小时。
8. 让小瓶升温至室温，并在摇摆平台上摇动24小时。这将允许整个样品渗透树脂。
9. 将样品转移至明胶胶囊，并用100％树脂填充胶囊形成弯月面。旋转盖子插入，以创建一个不含氧气的屏蔽。放入一个50°C的烤箱中，并在〜2天后取出。
10. 修剪样品，并用钻石刀切割90-100nm的切片（浅金色反射色），用二氯乙烷使切片发烟以拉伸切片。
  通过触摸300目金网格或200目镍网格的钝面来拾取部分
11. 将一个干净的滤纸放在封闭的CLEAN培养皿中，并在室温下干燥1-2小时，或将培养皿置于载玻片加热器（45-50°C）上30分钟。
12. 使用潮湿的室（参见注2）将一块牙蜡放在完全湿润的滤纸上，将网格浮在上面，在下面的溶液中将样品滴下10μl（所有这些溶液均离心并通过250nm过滤器过滤）和时间：
  1. 在0.05M磷酸钠缓冲液（BSA / PBS; pH 7.2）中的2％BSA过夜（封闭）。
  2. 在2％BSA / PBS中1:20稀释的初级抗体滴在室温下3-4小时。或者，网格可以在4℃保持在一抗过夜。
13. 冲洗网格放置在2％BSA / PBS 4×3分钟的水滴。
14. 将网格放置在10μl1/2稀释的二次金标记抗体的2％BSA / PBS'湿润室'中1-3小时。
15. 将网格移动到10μL0.02M PBS（FILTER and CENTRIFUGE）（用于冲洗4 x 3-5分钟）。
16. 用已经过滤（0.2微米）的双蒸蒸馏水冲洗每个网格，并使其干燥。
17. 将网格在2％乙酸铀酰中进行2分钟后染色，用双蒸压灭菌水洗涤，并在雷诺氏酸铅柠檬酸盐中染色30秒。在蒸馏水蒸馏水中洗涤，干燥并在透射电子显微镜下观察。

笔记

四氧化锇（OsO 4 4）是一种重要的固定剂，可以染色膜状结构和囊泡中的脂质。另外，减少的重金属增加生物组织的密度和对比度。
潮湿的房间是一个培养皿，其底部覆盖着一个新鲜，干净的湿滤纸，如果坐过夜，盖用石蜡密封。等份的BSA / PBS可以保持冷冻直到使用。使用前离心并冷藏（4°C）。每次标记1-2％BSA / PBS可分成小份（100-200μl），并保存在-20°C，最长可达6个月。
BSA / PBS中的一抗不应反复冷冻和解冻;它会降低酶的强度。
在标签过程中使用完全干净的工具和培养皿
Millipore过滤或离心每一种药物，只从上清液中提取，使用无菌过滤（0.2μm）水冲洗PBS，柠檬酸铅和醋酸铀酰染色液。
初级抗体的等分试样（40-50μl）必须保存在-20°C
含有金颗粒的二抗必须保持在4°C，切勿放在冰箱里。
标记试剂解冻后（等分试样）不要再冻结。
在4°C时最多3-4天
对于BSA / PBS以及其他液体的液滴大小可以在5到10微升之间，如果你停下来一个晚上使用10微升。
如果您停止上述任何步骤（将网格放入二抗之前），不应超过一夜，潮湿的室应密封并放在冰箱中。
注：网格不应该留在二抗中过夜，因为它会增加背景“噪音”（即标签）。
建议在将滤网移动到一个新的解决方案之前，并在同一个冲洗的不同步骤之间，在一小块滤纸上形成网格。
每次将网格移至新的解决方案时，请使用新的Parafilm（或冲洗并擦拭牙齿蜡）。
玻璃培养皿是首选。塑料创造静电并且导致栅格紧贴到盘子顶部。

食谱

0.01 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）

加入5份0.20 M Sorenson磷酸盐缓冲液（pH 7.2）至95份双蒸压水
0.05M磷酸盐缓冲液（pH7.2）

加入25份0.20M Sorenson's磷酸盐缓冲液（pH7.2）到75份双蒸压的高压灭菌水中
2.5％戊二醛
1. 将1份10％戊二醛加入1份双蒸压蒸馏水中
2. 将1份0.20M Sorensen's磷酸盐缓冲液（pH7.2）加入到1份双蒸蒸馏水中
3. 将1份5％戊二醛加入到1份0.10M Sorensen's磷酸盐缓冲液（pH7.2）中
2％四氧化锇水溶液

加1份4％四氧化锇水溶液到1份双蒸压蒸馏水中
0.02 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）
将10份0.20M Sorenson's磷酸盐缓冲液（pH7.2）加入到10份双蒸压的高压灭菌水中
抗体
添加1份抗体到20份2％PBS / BSA
2％PBS / BSA
将0.20g牛血清白蛋白加入到10ml 0.02M磷酸盐缓冲液（pH7.2）中
0.05 M PIPES缓冲液（pH 7.2）

加入1份0.30 M PIPES缓冲液（pH 7.2）至6份双蒸压蒸馏水
2％醋酸铀。
在50毫升双蒸压蒸馏水中加入1克醋酸铀。
1 N NaOH
将40.00克氢氧化钠溶于水中，使体积达到1升
雷诺的铅柠檬酸盐
1. 加入1.33克硝酸铅和1.76克柠檬酸钠到30毫升煮沸的蒸馏水中，冷却到室温，摇30分钟。
2. 加入8ml 1N NaOH
3. 加入12毫升双蒸压蒸馏水

致谢

这项研究得到了国家科学基金会的研究经费支持（DEB-0322664，DEB-0423625，DEB0521177和DEB-0228679），作为大学生研究经验和组装生命之树计划的一部分。
作者声明我们没有利益冲突或利益冲突。

参考

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