材料和试剂

螺旋盖管（AGC技术玻璃，硼硅酸硼玻璃，13毫米×120毫米）
玻璃测量吸管（0.1,0.5,1和2毫升）
巴斯德吸管IK-PAS-5P（IWAKI，目录号：73-0001）
来自牛角膜的硫酸角质素（SEIKAGAKU，目录号：400760）
干四糖（100μg）由ΔUA，N-乙酰-D-半乳糖胺（4S，6S），半乳糖，N-乙酰半乳糖胺乙酰基-D-葡糖胺（6S）。简而言之，将来自M.chinensis的KS分枝CS用软骨素酶ACII处理，并通过使用带有Docosil柱的HPLC进行分馏来收集得到的四糖。请参阅Higashi et。（2016）
的详细信息
二甲基亚砜，脱水（干燥的DMSO）（和光纯药工业，目录号：040-18032）
碘甲烷（CH 3 I）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：139-02662）
氯仿
氮气（> 99.995％）（Nippon Megacare）
三氟乙酸（TFA）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：204-02743）
醋酸（NACALAI TESQUE，目录号：00212-43）
N，N'-二甲基氨基吡啶（Wako Pure Chemical Industries，目录号：042-19212）
吡啶（NACALAI TESQUE，目录号：29509-25）
乙酸酐（Wako Pure Chemical Industries，目录号：011-00276）
己烷（NACALAI TESQUE，目录号：17935-05）
氢氧化钠（NaOH）（NACALAI TESQUE，目录号：31511-05）
甲醇（NACALAI TESQUE，目录号：21915-93）
二甲基亚砜（DMSO）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：043-07216）
0.5mol / L盐酸甲醇溶液（和光纯药工，产品目录号：080-07725）
四氢硼酸钠（NaBH 4）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：192-01472）
NaOH-DMSO悬浮液（见食谱）
在50％乙腈/水中的5％（v / v）吡啶（见配方）
NaBH4（5mg / ml）溶液（参见食谱）

设备

试管混合器（SEIKRGRKU，型号：TM-251）
离心机（KUBOTA，型号：5922型）
样品浓缩器（杭州Allsheng仪器，型号：MD200-2）
飞行时间质谱仪JMS-T100GCV（JEOL，型号：JMS-T100GCV）
ZB-5ms柱（0.25μm膜厚，0.25μm内径×30μm）（Phenomenex）
Agilent Technologies 7890A GC系统（Agilent Technologies，型号：Agilent 7890A GC）

程序

图1描绘了部分甲基化的糖醇乙酸酯（PMAAs）的制备。使用玻璃移液管加入所有试剂。

图1.由具有半乳糖残基的多糖制备部分甲基化的糖醇乙酸酯（PMAAs）的方案。（i）DMSO，NaOH-DMSO悬浮液，CH 3 I; （ii）TFA（2.5M）; （iii）在30％CH 3中的50％CH 3 CN / H 2 O，NaBH 4中的5％吡啶，包含0.03M NaOH; （iv）在CH 3 CN，吡啶，乙酸酐中的4- N，N-二甲基氨基吡啶。

部分甲基化糖的制备
1. 干燥四糖（100微克）在螺帽管。
2. 加200μl无水DMSO，超声30分钟。
3. 加入200μlNaOH-DMSO（见食谱）并涡旋。
4. 将含有样品的试管转移到冰上并加入100μl碘甲烷（CH 3 I）。
5. 超声5分钟，涡旋3次。
6. 再次加入50μlCH 3，在冰上孵育30分钟
7. 加入1毫升蒸馏水，然后涡旋。
8. 用玻璃吸管（1毫升）添加1毫升氯仿，涡旋1分钟，充分振摇管1分钟，涡旋1分钟。
9. 在室温下900×g离心5分钟。
10. 使用巴斯德吸管（抽吸）去除水分（上层）。
11. 为了洗涤含有甲基化碳水化合物的有机层，加入1毫升水，充分振摇管1分钟，然后涡旋30秒。在室温下900×g离心5分钟，用巴氏吸管（抽吸）除去水分。
12. 用1毫升水洗两次有机层
13. 使用样品浓缩器（图2），在氮气流下在40℃蒸发有机部分（下层）40分钟。
14. 用150μl2.5mol / L TFA溶解样品。充满氮气，用螺帽密封。
  在100°C孵育4小时
15. 使用样品浓缩器在40°C氮气流下蒸发样品40分钟
16. 在干燥的部分甲基化糖中加入500μl5％吡啶的50％乙腈/水（见食谱）。
  
  图2.使用样品浓缩器（MD200-2）在氮气流下于40℃下蒸发样品。将喷嘴插入置于铝干浴加热块中的玻璃管中。样品在氮气下于40℃干燥。
由部分甲基化的糖制备部分甲基化的糖醇乙酸酯（PMAAs）
1. 加入200微升5毫克/毫升的NaBH4溶液（见配方）到样品中，并在37℃孵育4小时。
2. 加入200μl乙酸，并使用样品浓缩器在40℃和氮气流下在1小时内蒸发样品（图2）。
3. 用1ml 0.1％（v / v）MeOH-HCl溶解样品，并在40℃和氮气流下在1小时内蒸发样品（图2）。重复此步骤四次。
4. 加入150μl5mg / ml的N，N'-二甲基氨基吡啶，50μl吡啶和150μl乙酸酐，室温孵育4小时。
5. 孵化后，加入2毫升蒸馏水。
6. 加入2ml氯仿，涡旋，在室温下900×g离心5分钟，除去水（上层）。
7. 加入2毫升蒸馏水，涡旋，900×g离心5分钟，除去水（上层）。
8. 在40℃氮气流下蒸发样品（有机层）40分钟（图2）
9. 用30μl己烷溶解样品。
GC-MS（Agilent Technologies 7890A GC系统）分析PMAA
1. 设置电子轰击电离，70 eV。
2. 载气，氦气以1.2毫升/分钟。
3. 设置分割减少样品注入。
4. 设置柱温箱温度程序：在100℃下3分钟，以4℃/分钟升高至160℃，在160℃下升高1分钟，然后以0.5℃/分钟升高至180℃，最终以20°C / min升至260°C，并在260°C保持10 min。
5. 将1μl正己烷中的PMAAs提交至GC-MS。

数据分析

提供小化合物片段质量的电子电离（EI）是用于GC-MS分析的最常见的电离形式。一般来说，由EI生成的碎片模式是复合依赖的。在聚糖的某些碎片离子的结构分析，电子电离色谱图（EIC）的情况下（ M / Z 45，117，161，233）是用于识别对应于PMAAs（Björndal - 甲基 - 半乳糖醇）从半乳糖的四糖中。在28.68分钟检测到中国猕猴（Higashiet al。，2016）。然而，从PMAAsΔUA，名词的乙酰基<子> d -galactosamine和名词的乙酰基<子> d - 葡糖胺没有被观察到。

笔记

对于从中华分离的M.chinensis分离KS分支的CS-E和从KS分支的CS-E制备四糖，请参见Higashi等人的详细描述（2016）。通常，CS的定量通过柱后HPLC通过检测由软骨素酶（Chase）获得的不饱和二糖进行。有趣的是，当来自中华稻蝗的CS用高浓度的Chase ACII处理而不是追赶ABC时，发现了未知峰。因此，收集未知峰并通过LC-MS / MS和GC-MS进行分析。在LC-MS / MS的分析，我们发现，未知峰由四糖，包括ΔUA，名词的乙酰基<子> d -galactosamine（4S，6S），己糖，HexNAc （S）。另外，GC-MS分析表明四糖中的己糖是半乳糖。最后，用二维核磁共振证实了四糖中的N-乙酰基 - D-葡糖胺（6S）。
来自 M的PMAA。
根据Anumula和Taylor（1992）的方法进行微小的修改

食谱

NaOH-DMSO悬浮液（事先准备）
1. 将0.2ml的50％（w / w％）的NaOH和0.4ml的甲醇在螺帽管中合并
2. 用6ml DMSO稀释，涡旋并超声处理3-5分钟
3. 在室温下，900×g离心10分钟，将DMSO在DMSO中的细分散液在室温下离心。
4. 用6ml新鲜DMSO重悬得到的沉淀物，并在室温下900×g离心10分钟。重复这个步骤两次
5. 用6ml无水DMSO重悬所得的沉淀物，脱水并在室温下900×g离心10分钟。重复这个步骤三次
6. 用4毫升无水二甲基亚砜悬浮沉淀，并储存在4°C
在50％乙腈/水中的5％（v / v）吡啶（事先制备）
1. 用蒸馏水准备1.9 ml的50％乙腈
2. 结合0.1ml吡啶和1.9ml 50％乙腈/水
NaBH 4（5mg / ml）在含有0.03mol / L NaOH的30％甲醇中的溶液（事先制备）
1. 准备0.03 mol / L的氢氧化钠在30％甲醇中的溶液
2. 用含有0.03mol / L NaOH的30％MeOH溶解NaBH 4。

致谢

我们感谢Sayaka Masuko博士在准备这份手稿方面的帮助。这个协议是从原来的工作（Higashi et。，2016年）改编，提供详细的程序。这项研究得到了日本文部科学省和日本千叶大学的Inohana基金会的科学研究资助。

参考

Anumula，K.R。和Taylor，P.B。（1992）。一种从糖蛋白碳水化合物制备部分甲基化糖醇乙酸酯的综合方法 Anal Biochem 203（1）：101-108。
Björndal，H.，Hellerqvist，C.G.，Lindberg，B。和Svensson，S.（1970）。多糖甲基化分析的气液色谱和质谱法 Angew Chem Int Ed Engl 9：610-619。
Higashi，K.，Takeda，K.，Mukuno，A.，Okamoto，Y.，Masuko，S.，Linhardt，R.J。和Toida，T。（2016）。鉴别来自Mactra chinensis的硫酸软骨素葡糖醛酸的C-3位的硫酸角质素二糖。 Biochem J 473（22）：4145-4158。