材料和试剂

聚苯乙烯泡沫塑料瓶中的50ml锥形管（Corning，Falcon ，产品目录号：352098）
称量船，中小型（Dyn-A-Med Plus，目录号：80051,80056）
150毫米培养皿（Corning，Falcon ，产品目录号：351058）
PS-10小瓶（AS ONE，目录号：9-892-12）
磨砂玻璃（松浪玻璃，产品目录号：S024410）
单刃剃须刀（FEATHER安全剃刀，目录号：99129）
画笔（Arteje刷Camlon临，模型630＃3/0回合）
Kimwipe
多聚甲醛（Merck，目录号：104005）
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：197-09705）
磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：197-02865）
蔗糖（Wako Pure Chemical Industries，目录号：190-00013）
明胶（Wako Pure Chemical Industries，目录号：077-03155）
（和光纯药工业，目录编号：081-04215）
Triton X-100（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610407）
吐温-20（Bio-Rad Laboratories，目录号：1706531）
抗酪氨酸羟化酶（Enzo Life Sciences，目录号：BML-SA497-0100）
硫翁（Alfa Aesar，目录号：A18912）
标准ABC过氧化物酶试剂盒（Vector Laboratories，目录号：PK-4000）
金属增强型DAB试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：34065）
Entellan新安装介质（Merck，目录号：107961）
兔抗ChAT结合皂素（高级靶向系统，目录号：IT-42）
Mouse Anti-NeuN（Abcam，产品目录号：ab104224）
山羊抗ChAT（EMD Millipore，目录号：AB144P）
生物素结合的山羊抗兔IgG（Thermo Fisher Scientific，目录号：B-2770）
生物素缀合的山羊抗小鼠IgG（Thermo Fisher Scientific，目录号：B-2763）
生物素缀合的兔抗山羊IgG（Thermo Fisher Scientific，目录号：A10518）
4％PFA / 0.1M PB（4％多聚甲醛/0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.4）（见食谱）
0.1M PB（0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.4）（见配方）
30％蔗糖0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.4（见食谱）
4％多聚甲醛/ 10％蔗糖在0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.4中（参见食谱）
0.05M PB（0.05M磷酸盐缓冲液，pH7.4）（见食谱）
30％蔗糖0.05M磷酸盐缓冲液，pH7.4（见食谱）
阻止解决方案（见食谱）
抗体溶液（见食谱）
在H 2 O中的0.5％w / v明胶（参见配方）

设备

支架50毫升锥形管
温度计
勺子刮刀
Spin-plus 19毫米磁力搅拌棒（SP Scienceware-Bel-Art Products-H-B Instrument，目录号：F37144-0034）和磁性旋转棒去除工具
2×500毫升烧杯（DWK生命科学公司，Duran ，产品目录号：2110648）
用于PFA /凝胶（AS ONE，目录号：4-5308-03）的5L废液桶
弯钳（Ideal-Tek，型号：650.S.6）
烤箱（SANYO，型号：MIR-162）
具有磁力搅拌功能的热板（IKA，型号：C-MAG HS 7）
冰箱（SANYO，型号：MPR-414FR）
通风柜
颤音（Leica Biosystems，型号：Leica VT1000 S）
直立式光学显微镜（奥林巴斯，型号：CX22LED）

程序

明胶嵌入
1. 用0.1M磷酸盐缓冲液（PB）（见食谱）洗涤4％PFA / 0.1M PB（参见食谱），灌注72小时后固定的大脑，并将脑浸入30％蔗糖/0.1M PB（参见食谱）在50ml锥形管中。使用磁力搅拌棒顶部15毫升倒锥形管帽，以帮助保持大脑淹没在管。
  4°C孵育过夜（18小时）。
2. 倾倒30％蔗糖/0.1M PB，并用50℃双蒸水（ddH 2 O）代替，并将包含脑的管在55℃培养箱中培养45分钟以平衡大脑的温度。继续使用磁力搅拌棒和圆锥形帽来淹没大脑，在50-55°C之间的所有后续步骤。
3. 当大脑温度达到平衡时，预热明胶制备热板，确保热板温度不超过60°C。
4. 制成14％明胶/ 10％蔗糖溶液（25ml /脑）;对于500ml（20个脑），使用磁力搅拌棒从缓慢到快速的速度将70g明胶逐渐添加到450ml的50℃ddH 2 O中，这将拉入明胶而不引起团块（视频1）。
5. 一旦明胶溶解后，加入50克蔗糖，并用50℃ddH 2 O使体积达到500毫升。
6. 通过将150ml ddH 2 O预热至55℃制备7％明胶/ 5％蔗糖溶液，并将150ml 14％明胶/ 10％蔗糖加入到预热的ddH > 2 O，将所有明胶溶液置于55°C烘箱（视频1）。
  
  视频1
7. 滗析温热的ddH 2 O将大脑浸入7％明胶溶液/ 5％蔗糖中，旋转，在55℃孵育2小时（视频2）。
  
  视频2
8. 倒入7％明胶溶液/ 5％蔗糖，将其浸入14％明胶溶液/ 10％蔗糖中，旋转，并在55℃下孵育3小时。
9. 马克用动物身份证号码称重船只。
10. 使用勺子刮刀，迅速并小心地将大脑和液体内容物移入冰块上的大培养皿顶上的称重船。取下泡沫，取出大脑，用弯钳轻轻压下，直到底部开始凝固（大约7-10分钟，视频3）。
  
  视频3
11. 将大脑移动到4°C的冰箱，再等待90分钟。
12. 用动物ID号标记样品瓶。
13. 用新的单刃刀片小心切出铸造的大脑，并将其滑入样品瓶中。
14. 将0.1M PB中的4％PFA / 10％蔗糖（见食谱）加入装有脑的小瓶中，将小瓶置于冰箱中过夜（18小时）。
15. 去除PFA，用0.05M PB（参见食谱）冲洗一次，用30％蔗糖/0.05M PB代替（见食谱）。保持样品瓶在冰箱至少72小时。
顺序切片收集
1. 包埋后，每只动物标记3至4个小瓶。（即，动物ID-＃1至3或4）
2. 切割包括感兴趣区域的块，修剪块并系统地切割对角线，以便在安装期间正确定位切片（ ie ，相对于块的正面的右上角和左下角）。 />
3. 收集0.05 M PB切片机或vibratome切片，并连续放置3至4小瓶。在第三个或第四个小瓶后回到第一个小瓶（图1）。
  从vibratome的40-80微米之间的部分通常效果最好。
  
  图1.安装步骤中切片装置和切片后免疫染色装置的切片收集示意图切片按照图中所示顺序收集在编号的小瓶中。完成免疫染色程序后，将每个小瓶的切片放置在一个大培养皿中的柱中，下一个小瓶的柱布置在前一个小瓶的旁边。一旦安排，串行安装是通过逐行移动来实现的。由于切片之间的距离更大，顺序瓶收集的布置更简单。这样就可以更加准确地将切片彼此区分开来，从而更快速地进行安装。
免疫染色
用户选择：荧光标记或IHC。简而言之，图2和3中所示的实例通过以下程序染色。
1. 用0.05％PB预处理样品3％H 2 O 2 20分钟，然后将样品与封闭溶液一起孵育1小时（参见食谱）。 />
2. 滗析封闭溶液并在抗体溶液中添加原色（参见配方，1:100 [抗ChAT]; 1：1,000 [抗-TH]，1：1,000 [抗NeuN]），在4℃孵育48小时。
3. 颂扬初选。用PBS清洗5分钟，3次。
4. 在抗体溶液（1：400抗山羊，ChAT，抗TH的抗兔和NeuN的抗小鼠）中加入生物素结合的二抗，在25°C孵育4 h。
5. 斟酌二手。用PBS清洗5分钟，3次。
6. 加入标准的ABC过氧化物酶溶液，按照制造商的方案稀释在PBS和0.2％Tween-20中，在25℃孵育4小时。
7. 滗ABC ABC过氧化物酶溶液。用PBS清洗5分钟，3次。
8. 根据制造商的协议制作DAB工作解决方案并添加到切片中。等待约3-5分钟的信号发展，并停止反应与四个0.1 M PB洗。
9. 倒出ABC过氧化物酶溶液并用PBS洗涤5分钟，3次。
10. 将切片储存在0.05 M PB中。
免疫染色后连续安装
1. 将第一个小瓶中的内容物用0.01M PB（在H 2 O中0.05M PB的1:5稀释液）倒入大培养皿中，并使用精细画笔排列在柱中。
2. 仔细移动第二个小瓶的内容，并安排在第一个小瓶的列旁边的列。
3. 重复，直到所有的小瓶被排列成彼此相邻的列。
4. 使用画笔将相邻的连续切片放置在幻灯片上，逐行移动（图1和图2）
5. 如果干式IHC切片，通过在ddH 2 O（在ddH 2 O中稀释1：4 0.5％w / v明胶）包被0.12％w / v明胶来制备载玻片，参见食谱）用一把中等尺寸的称重船的画笔。通过将磨砂侧面放在称重船的方形边缘上，并将水下的一侧放在喷口的底部斜面上（视频4），将半边玻璃留下。
6. 将大片培养皿中的初始切片移入含有0.12％明胶的中等重量的船中，将切片置于溶液中，定位切片，然后小心地将切片滑到离滑片的浸没边缘的适当位置。
7. 将滑块推向称重舟的喷口，从0.12％的明胶中暴露更多的载玻片，并在步骤D6中重复相邻切片的过程以填充载玻片的其余部分。
8. 在Kimwipe上的干燥的滑动边缘上，在22°C空气干燥24小时，然后进行复染，脱水，固定介质和盖玻片的放置。
  
  视频4
  
  图2.使用连续切片将套管定位在腹侧被盖区（VTA）中。用含辣根过氧化物酶和3'，3'-二氨基联苯胺（DAB）显色的抗酪氨酸羟化酶染色明胶嵌入的大鼠脑切片。将切片干燥固定在载玻片上，用0.02％硫堇复染3分钟，通过乙醇脱水系列并用Entellan固定培养基盖上盖子。六个80微米的连续切片顺序安装，从左上方沿水平方向移动到右下方，小瓶和切片编号标记在切片上方（请参见图1中小瓶和切片的来源）。

数据分析

使用Olympus CX22LED光学显微镜（图2）验证大鼠VTA中套管放置的定位。另外，通过使用Olympus CX22LED光，定性分析大鼠纹状体中立体定向注射的抗ChAT-皂草素抗体定向损伤（Aoki等人，2015，图3）的程度的验证和作图显微镜和解剖标志从老鼠大脑地图集（Paxinos和沃森，2004年）。

图3.抗体靶向免疫毒素递送至大鼠纹状体中的胆碱能神经元的验证和病变作图A.大鼠纹状体DAB染色的切片的代表性冠状切片显示大部分完整的NeuN染色，但是胆碱能细胞特异性缺失中间神经元在兔抗ChAT-皂草素介导的损伤病例（箭头背内侧层，DMS或腹侧纹状体，VS）中进行ChAT染色。比例尺= 1毫米。 B.使用非选择性山羊IgG-皂草素注射液作为对照（箭头）的由虚线区域（NeuN）表示的有限的非特异性损伤的实例，其中出现较少的细胞并且实例更广泛的非特异性缺失。 C和D.在每个行为条件中显示胆碱能神经元缺失的最受限制的（实心黑色）和最广泛的区域（灰色）。坐标距前囟切片的距离显示在左边。 DMS（C）和VS（D）中病变的程度在所有情况下都相似。 DAB染色照片中的解剖标志：LV，侧脑室; CC，胼体; AC，前连合。图经过修改以进行澄清并经过许可转载（Aoki等人，2015年）。

笔记

强烈建议小瓶和称量的小船在动物身份证前用手标记，并且小心地将大脑从一个容器转移到另一个容器，以确保不会混淆个人的身份。

食谱

4％PFA / 0.1M PB（4％多聚甲醛/0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.4）
在ddH 2 O中的4％w / v多聚甲醛 80mM Na 2 HPO 4 4/2 20 mM NaH 2 PO 4 4
0.1M PB（0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.4）
在ddH 2 O中的80mM Na 2 HPO 4： 20 mM NaH 2 PO 4 4
30％蔗糖/0.1M PB（30％蔗糖0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.4）
在ddH 2 O中30％w / v蔗糖 80mM Na 2 HPO 4 4/2 20 mM NaH 2 PO 4 4
4％多聚甲醛/ 10％蔗糖的0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.4中在ddH 2 O中的4％w / v多聚甲醛 20％w / v蔗糖
80mM Na 2 HPO 4 4/2 20 mM NaH 2 PO 4 4
0.05M PB（0.05M磷酸盐缓冲液，pH7.4）
在ddH 2 O中的40mM Na 2 HPO 4： 10 mM NaH 2 PO 4 4
30％蔗糖0.05M磷酸盐缓冲液，pH7.4
在ddH 2 O中30％w / v蔗糖 40mM Na 2 HPO 4 4 10 mM NaH 2 PO 4 4
阻止解决方案
1x PBS
5％中学宿主血清
0.2％Triton X-100
抗体解决方案
1x PBS
2％中学宿主血清
0.2％Triton X-100
在ddH 2 O中0.5％w / v明胶 ddH 2 O至50℃
0.5％w / v明胶

致谢

我们感谢Tom Ruigrok博士提供了明胶包埋的初始方案，Mayank Aggarwal允许我们在图2所示的VTA中显示套管放置的彩色玻片。我们也非常感谢FrançoisBeauchain进行批判性校正，Yumiko Akamine提供帮助与视频制作。最后，我们把我们的帽子给安德烈斯卡拉斯科，呼吁我们注意生物协议。
来自人类前沿科学计划（AWL，JRW）的支持，JSPS对挑战性探索性研究的资助，JSPS研究员的资助以及A类青年科学家的资助（SA）进行了研究在这个出版物可能。作者声明没有竞争的财务利益。

参考

Aoki，S.，Liu，A.W。，Zucca，A.，Zucca，S.and Wickens，J.R。（2015）。纹状体胆碱能中间神经元在大鼠移位中的作用 J Neurosci 35（25）：9424-9431。
Aquili，L.，Liu，A.W。，Shindou，M.，Shindou，T。和Wickens，J.R。（2014）。在特定的时间段，伏隔核神经元的光遗传学抑制增加了行为的灵活性。 a> Learn Mem 21（4）：223-231。
Griffioen，H.A.，Van der Beek，E.和Boer，G.J。（1992）。明胶包埋保存病灶损伤的下丘脑和脑室移植物，用于振动切片和免疫细胞化学。
J Neurosci方法 43（1）：43-47。
Paxinos，G.和Watson，C。（2004）。老鼠脑在立体坐标。
Suzuki，L.，Coulon，P.，Sabel-Goedknegt，E.H。和Ruigrok，T.J。（2012）。组织脑部投射到小鼠小脑后部小脑区。< J Neurosci 32（32）：10854-10869。