材料和试剂

生物材料
1. 胚芽橄榄培养物，由黄色奶油色的愈伤组织和球状胚胎结构形成
2. 含有感兴趣基因和nptII选择基因的双元载体的农杆菌AgL1菌株
化学品和材料
1. 无菌滤纸切成10 x 10厘米（Filtros Anois，FILTER-LAB ，产品目录号：RM13054252）
2. 培养皿（90cm）（J.D.CATALAN，S.L。）
3. 网格，3×3（ALBUS Suministros de Laboratorio）
4. 活性炭（Sigma-Aldrich，目录号：C9157）
5. 测定管（25×150mm）（Kimble Chase生命科学和研究产品，目录号：73500-20150）
6. 透析管纤维素膜（Sigma-Aldrich，目录号：D9777-100FT）
7. Jiffystrips 5-50泥炭盆平方米，4.5 x 4.5厘米（Jiffy，目录号：110007）
8. 植物盆（12.5和20厘米）
9. 1：1泥炭苔：珍珠岩基材（Projar专业）
10. 液体生长培养基（LB培养基）（AppliChem，目录号：414753）
11. 10mM硫酸镁（MgSO 4）（AppliChem，目录号：131404）
12. 抗生素：
  1. 巴龙霉素（Duchefa Biochemie，目录号：P0141）
  2. 头孢噻肟（PhytoTechnology Laboratories，目录号：C380）
  3. 特美汀（Duchefa Biochemie，目录号：011258）
13. ¼OM（Cañas和Benbadis，1988）macroelements
14. ¼MS（Murashige和Skoog，1962）微量元素
15. ½OM维生素
16. Myo肌醇（Sigma-Aldrich，目录号：I5125）
17. 蔗糖（D（+） - 蔗糖）（VWR，目录号：27478.467）
18. L-谷氨酰胺（Biowest，目录号：P1012）
19. 酪蛋白水解产物（N-Z-胺）（Sigma-Aldrich，目录号：C0626）
20. 甘露醇（Sigma-Aldrich，目录号：M9647）
21. 植物激素：
  1. N6-2-异戊烯腺嘌呤（2iP）（Duchefa Biochemie，目录号：D0934）
  2. N6-苄基腺嘌呤（BA）（Duchefa Biochemie，目录号：B0904）
  3. 吲哚-3-丁酸（IBA）（Sigma-Aldrich，目录号：I5386）
  4. 玉米素核苷（ZR）（Duchefa Biochemie，目录号：Z0917）
22. 橄榄循环胚胎发生培养基（ECO）（见食谱）
23. 发芽介质（见食谱）
24. 拍摄增殖介质（见食谱）
25. 植物生根培养基（见食谱）

设备

培养瓶（125毫升）（Nalgene）
高压灭菌器（JP SELECTA，型号：Autester MOD 437-G）
恒温/轨道摇床培养箱（光学常春藤系统）
层流罩（Telstar，型号：BH-100）
实验室离心机（Sigma Laborzentrifugen，型号：3K30）
分光光度计（JP SELECTA，型号：UV-2005）
走在植物生长柜内，控制光照和温度条件。

程序

注：所有这些协议必须在严格的无菌条件下在层流罩中进行;除了B7步骤和分子分析。

农杆菌介导的橄榄胚发生愈伤组织的转化
1. 获得来自成熟种子胚根的胚发生橄榄培养物（Orinos和Mitrakos，1991）。将含有球形胚的胚胎发生脆性愈伤组织（图1A）维持并在ECO培养基上繁殖（见食谱），在25±2℃的黑暗中以4周的时间间隔转移至新鲜培养基中（Pérez-Barranco等人。，2009）。
2. 培养根癌农杆菌AgL1菌株，其含有携带目的基因和选择基因的二元质粒（pBINUbiGUSInt作为实例;含有uidA 和在LB培养基中28℃和250rpm下培养24小时（对于使用的质粒，使用合适的抗生素），在0.5OD 600nm处获得40ml的培养物，子>。然后，将培养物在4,000×g离心，用10mM MgSO 4洗涤沉淀物而不摇动，并将其稀释在液体ECO培养基中，保持最终的0.5OD 600 nm 。
3. 在稀释的土壤杆菌悬浮液中温育搅拌20分钟，从球形胚愈伤组织中分离1-2mm直径的球形体细胞胚;将约20个胚胎移植到约10ml含有总计80个胚胎的农杆菌悬液中（图1B）。然后，在无菌滤纸上干燥胚胎（图1C）。
4. 在ECO固体培养基上共同培养感染的体细胞胚在黑暗中48小时，每个平板15-20个胚胎（图1D）。
5. 之后，用补充有250mg / L头孢噻肟和250mg / L特美汀的ECO液体培养基洗涤体胚（图1E）。在滤纸上将胚胎干燥（图1F）并将其转移到选择培养基上;即补充250mg / L头孢噻肟，250mg / L特美汀和200mg / L巴龙霉素的ECO固体培养基（图1G）。在第一个月和第二个星期每周重新培养外植体到新鲜的选择培养基上。
6. 当外植体在选择培养基上显示巴龙霉素抗性胚发生愈伤组织的增殖（图1H）时，大约培养3个月后，将这些愈伤组织分别转移到250ml培养瓶中，加入40ml ECO液体培养基，补充25-50mg / L巴龙霉素（图1I）。将轨道摇床中的悬浮液在黑暗中以120rpm的速度培养3周。
7. 之后，通过3×3mm的筛子筛分悬浮液（图1J），并在具有200mg / L巴龙霉素的ECO选择培养基的平板上分别培养小球形胚。两个月后，增殖愈伤组织转移到试管中（图1K）。
8. 在选择培养基上生长的愈伤组织可以通过PCR进行分析以获得初步的转化验证（图1L）。
  
  图1.经由根癌农杆菌转化橄榄体细胞胚的序列A.分离的体细胞胚; B.在稀释的根癌土壤杆菌悬浮液中接种体细胞胚胎; C.接种后在无菌纸上干燥体细胞胚; D.体细胞胚与土壤杆菌在固体培养基上的共培养; E.在补充有抗生素的液体培养基中洗涤体细胞胚胎; F.洗涤后将体细胞胚在滤纸上干燥; G.将体细胞胚培养到选择培养基上，补充抗生素; H.选择培养基上抗性胚发生愈伤组织的生长; I.在液体选择培养基中温育抗性胚发生愈伤组织; J.获得胚胎发生愈伤组织的细小部分（1-3毫米）; K.在固体选择培养基上增殖推定的转基因愈伤组织以增殖; L.电泳凝胶中的PCR验证。比例尺= 10毫米。
转化的橄榄植物的再生
1. 一旦巴龙霉素抗性胚发生愈伤组织的转基因性质已经通过PCR得到证实，按照Cerezo等人描述的方案，可以开始从这些愈伤组织再生转基因植物的过程。（2011年）。首先，在ECO液体培养基中培养各种独立的胚性愈伤组织，以获得1-3mm大小的球形胚，例如将0.5g愈伤组织培养于50ml培养基中，120rpm，4周黑暗，然后通过3×3毫米的筛网过滤（图2A-2C）。
2. 将离体的小球状胚胎在培养皿中培养4周（不含激素或头孢噻肟并添加1g / L活性炭）到ECO成熟培养基上。在黑暗中孵育胚胎，每个平板20个球状胚胎（图2D）。
3. 将胚直接转移到4×4cm透析管顶部的纤维素膜部分上，将其置于新鲜的ECO成熟培养基上，并在黑暗中再孵育4周（图2E）。这些膜根据制造商的说明书制备并且通过高压灭菌器消毒。
4. 之后，在光照条件下（16h光周期，40μmolm -2 s -1辐照度水平），在发芽培养基的子叶阶段培养成熟胚胎（参见食谱）。（图2F）
5. 将获得的芽转移到补充有5.6μMZR（图2H）的培养基中进一步增殖。
6. 为了诱导生根，将具有2-3个节点（2-3cm）的枝条转移到补充有0.5μMIBA（图2G-2I）的DKW生根培养基（参见食谱）。
  
  图2.橄榄转化植物的再生序列A.转化的胚性愈伤组织在选择培养基上的生长; B.在液体培养基中培养转基因愈伤组织; C.获得细胚胎发生培养物（1-3毫米）; D.将小转化的分离的胚胎培养到ECO成熟培养基上; E.转化的预成熟胚胎到ECO成熟培养基上的醋酸纤维素膜上培养; F.在发芽培养基中培养转化的成熟胚胎; G.转化的橄榄苗; H.转化的植物在增殖培养基中生长; I.在生根培养基中转化橄榄植物。比例尺= 10毫米。
7. 在温室中使生根的植物适应外部条件。用蒸馏水清洗根部，并将植物转移到1：1泥炭苔：珍珠岩基质上，并用半透明塑料盖覆盖托盘。逐渐地，通过增加暴露于环境湿度以打开盖子来使植物适应<体外条件。
  植物转移到更大的盆栽（图3A-3D）
8. 进行Southern或Northern分析以确认再生植物的转基因性质
  
  图3.在温室中回收转化的橄榄植物的序列。：一种。一个发展良好的转化橄榄植物; B.转化的橄榄植物适应1：1泥炭苔：珍珠岩基质的jiffy托盘; C.在12.5厘米盆中转化的橄榄植物; D.在15厘米盆中转化橄榄植物。比例尺= 25毫米。

数据分析

每个转化试验使用至少50个外植体，每个转化试验3个重复。在液体培养基中选择后，在巴龙霉素的存在下，将转化效率估计为在选择培养基上生长的外植体的百分比。

笔记

感染后使用的选择压力是基因型依赖性的;例如，巴龙霉素的浓度可以在固体培养基中150-200mg / L和液体培养基中25-50mg / L之间变化。此外，对于一些基因型，选择压力增加是可取的，从固体培养基中的50毫克/升巴龙霉素开始，增加到100,150和最终200毫克/升。

食谱

注意：使用NaOH或HCl将所有介质的pH值调整到5.7。

橄榄循环胚胎发生培养基（ECO）（Pérez-Barranco等人，2009）
¼OM（Cañas和Benbadis，1988）macroelements
¼MS（Murashige和Skoog，1962）微量元素
½OM维生素
0.05克/升肌醇 - 肌醇
20克/升蔗糖
0.550克/升谷氨酰胺
1克/升酪蛋白水解物
0.5μM2iP
0.44μMBA
0.25μMIBA
0.42μM头孢噻肟
萌发培养基（Cerezo et al。，2011）
修改MS媒体
⅓宏元素
0.1克/升myo-inositol
10克/升蔗糖
拍摄增殖介质（Vidoy et。，2012）
改良的RP介质（Roussos和Pontikis，2002）
1克/升myo -inositol
20克/升甘露醇
1.2克/升谷氨酰胺
5.6μMZR
植物生根培养基（Revilla等人，1996）
半强度DKW培养基（Driver and Kuniyuki，1984）盐类，不含维生素或氨基酸。
2％蔗糖
0.5μMIBA

致谢

该协议是从以下发表的论文中发展出来的：2011年的Torreblanca等人和Cerezo等人。2011年的这项工作得到了P11-AGR-7992-军政府安达卢西亚，西班牙。作者没有利益冲突。

参考

Cañas，L.A。和Benbadis，A。（1988）。橄榄树子叶碎片（ > Olea europaea L.）植物科学 54：65-74。
Cerezo，S.，Mercado，J.A。和Pliego-Alfaro，F。（2011）。通过橄榄体细胞胚胎发生的高效再生系统
。植物细胞Tiss器官邪教 106（2）：337-344
Driver J.A.和Kuniyuki A.H。（1984）。 Paradox Walnut 砧木的体外繁殖 > HortScience 19（4）：507-509。
Haberman，A.，Bakhshian，O.，Cerezo-Medina，S.，Paltiel，J.，Adler，C.，Ben-Ari，G.，Mercado，JA，Pliego-Alfaro，F.，Lavee，S。和Samach，A.（2017）。开花位点T编码基因在解释影响橄榄的环境和内部线索中的可能作用> Olea europaea L.）花诱导。 Plant Cell Environ 40（8）：1263-1280。
Murashige T.和Skoog F.（1962）。烟草组织培养快速生长和生物测定的修正培养基。 Physiol Plant 15：473-497。
Orinos，T.和Mitrakos，K.（1991）。野生橄榄愈伤组织的根际发生和体细胞胚胎发生（ Olea europaea var。sylvestris（ Miller）Lehr）成熟的合子胚胎。植物细胞Tiss器官Cult 27（2）：183-187。
Pérez-Barranco，G.，Torreblanca R.，Padilla，I.M.G.，Sánchez-Romero，C.，Pliego-Alfaro，F.和Mercado，J.A。（2009）。橄榄（橄榄油橄榄）体细胞胚胎的遗传转化研究：一，评价（1）橄榄油（橄榄油橄榄油）不同的氨基糖苷类抗生素用于选择 nptII 。 II。通过粒子轰击的瞬时转化。植物细胞Tiss器官邪教 97：243-251。
Revilla，M.A.，Pacheco，J.，Casares，A。和Rodríguez，R.（1996）。体外成熟橄榄树的恢复活力（ Olea europaea L.）通过微接枝移植。体外细胞开发生物植物 32（4）：257-261。
Roussos，P.A。和Pontikis，C.A。（2002）。橄榄的体外传播（ Olea europaea L。）cv。 Koroneiki。植物生长调节 37：295-304。
Rugini，E.，Rita，B.和Rosario，M。（2000）。 Olive（ Olea europaea
Torreblanca，R.，Cerezo，S.，Palomo-Ríos，E.，Mercado，J.A。和Pliego-Alfaro，F.（2010）。开发用于橄榄遗传转化的高通量系统（Olea europaea L.植物植物细胞Tiss器官崇拜103（1）：61-69。
Vidoy-Mercado，I.，Imbroda-Solano，I.，Barceló-Muñoz，A.和Pliego-Alfaro，F.（2012）。西班牙橄榄（体外行为） em> Olea europaea L.）品种'Arbequina'和'Picual'。 Acta Horticulturae 949：27-30。