材料和试剂

1.5 ml离心管（SARSTEDT，目录号：72.690.001）
移液器吸头（DNase / RNase-free）
DT40细胞（理化生物资源中心）（举例）
10μMcrRNA（FASMAC，稀释在无DNase / RNase的水中）（见步骤B1）
10μMtracrRNA（FASMAC，稀释在无DNase / RNase的水中）（见步骤B1）
3xFLAG-dCas9-D（Sysmex，ProCube）
37％的甲醛（NACALAI TESQUE，目录号：16223-55）
抗FLAG M2抗体（Sigma-Aldrich，目录号：F1804）
正常小鼠IgG（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-2025）
Dynabeads-Protein G（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：10004D）
RNasin加RNA酶抑制剂（Promega，目录号：N261A）
10mg / ml RNA酶A（Sigma-Aldrich，目录号：R6513）
10％SDS溶液（NACALAI TESQUE，目录号：30562-04）
20mg / ml蛋白酶K（Roche Diagnostics，目录号：3115828001）
ChIP DNA Clean and Concentrator（ZYMO RESEARCH，目录号：D5205）
TruSeq ChIP样品制备试剂盒（Illumina，目录号：IP-202-1012）
氯化钾（KCl）（NACALAI TESQUE，目录号：28538-62）
二硫苏糖醇（DTT）（NACALAI TESQUE，目录号：14128-91）
1M HEPES（pH7.1-7.5）（NACALAI TESQUE，目录号：17557-94）
0.5M乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）（NACALAI TESQUE，目录号：06894-85）
1M氯化镁六水合物（MgCl 2•6H 2 O）（NACALAI TESQUE，目录号：20942-34）
完全，微量，不含EDTA的蛋白酶抑制剂（Roche Diagnostics，目录号：4693159001）
UltraPure DNase / RNase-Free Distilled Water（DDW）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：10977015）
10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH7.4）（NACALAI TESQUE，目录号：27575-31）
1x PBS（用蒸馏水10倍稀释10倍PBS）
吐温-20（Sigma-Aldrich，目录号：P5927）
注：此产品已停产。
BSA级分V（7.5％）（Thermo Fisher Scientific，目录号：15260037）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9625）
1M Tris（pH8.0）（AppliChem，目录号：A4577）
1M Tris（pH 7.5）（AppliChem，目录号：A4263）
聚乙二醇单对异辛基苯基醚（Triton X-100）（NACALAI TESQUE，目录号：12967-45）
IGEPAL CA-630（Sigma-Aldrich，目录号：I8896）
3xFLAG肽（Sigma-Aldrich，目录号：F4799）
1 M KCl（见食谱）
0.1 M DTT（见食谱）
体外CRISPR缓冲液（+ 0.5mM DTT）（见食谱）
PBS-T（见食谱）
PBS-T-BSA（见食谱）
5 M NaCl（见食谱）
改良低盐缓冲液（+ 0.04％SDS）（见食谱）
TBS（见食谱）
TBS-IGEPAL CA-630（见食谱）
洗脱缓冲液（见食谱）

设备

移液器
超声波干扰器（TOMY SEIKO，型号：UD-201）
座式加热器（Eppendorf，目录号：5355 000.046）
磁性支架（魔法捕手）（TOYOBO，目录号：MGS-101）
离心机（Eppendorf，目录号：5427 R）
涡旋混合器（Fisher Scientific，目录号：128101）
旋转器（AS ONE，产品目录号：TR-118）
HiSeq 2500系统（Illumina，型号：HiSeq 2500系统）

软件

Integrative Genomics Viewer， http://software.broadinstitute.org/software/igv/IGV

程序

超声处理染色质的制备
1. 将细胞（例如2×10 7 DT40细胞，在培养基中的1％甲醛在37℃下5分钟）的甲醛交联和染色质的制备如所述进行先前（藤田和藤井，2014b步骤B和C）。
2. 先前使用超声波干扰器UD-201（TOMY）超声处理制备的染色质（例如，输出：3，占空比：100％，时间：自由，10秒×15个循环）和Fujii，2014b），除了用800μl的体外CRISPR缓冲液（+ 0.5mM DTT）（参见食谱）代替MLB3外。
3. 如前所述评估染色质片段化（平均片段长度约为2kbp）（藤田和藤井，2014b步骤E）。
制备gRNA
1. 混合2μL10μMcrRNA和2μL10μMtracrRNA。在我们之前的研究（Fujita等人，2017a）中，使用crRNA（cggcaggcucgggugcgccuguuuuagagcuaugcuguuuug）和tracrRNA（aacagcauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaagaggcaccgagucggugcuuuuuuu）靶向鸡Pax5启动子区域;带下划线的序列对应于目标网站。
2. 在100°C的环境中加热2分钟。孵育2分钟不会产生相当大的蒸发。加热后，将RNA从加热器中取出，自然冷却至室温。 RNA已准备好进行D6步。
与抗体缀合的Dynabeads（抗FLAG抗体或正常小鼠IgG）的制备
1. 准备两个1.5毫升管;一个是抗FLAG抗体，另一个是正常小鼠IgG。在每个管中加入20μlDynabeads-Protein G的浆液（20μl×2管）。在这方面，我们通常使用20μl珠子浆液2μg抗体（见步骤C7）。在这个协议中，我们描述了用于NGS分析的一个样品的制备。在这方面，在步骤E1中使用正常的小鼠IgG进行预清除，在程序D中使用抗FLAG抗体。如果处理另一个样品（例如），则不用作为阴性对照的gRNA进行亲和纯化），您可以分别为其配制染色质和Dynabeads。
2. 将磁力管置于冰上3分钟。弃去上清液。
  在Fujita和Fujii，2014b的图2中对使用磁性支架的详细说明进行了说明
3. 用0.5ml的PBS-T重悬沉淀（参见食谱）。将磁力管置于冰上3分钟。
  弃去上清液
4. 重复步骤F3（总共两次）。
5. 在0.5毫升PBS-T-BSA中重悬沉淀（见食谱）。
6. 向抗FLAG或正常小鼠IgG的珠子中加入2μg抗体。 4°C旋转过夜。至于与抗FLAG抗体结合的Dynabeads，进行程序D.对于与正常小鼠IgG结合的Dynabeads，进行下一步骤（C7）。
7. 短暂离心（400 g x g，持续2-3秒）。将磁力管置于冰上3分钟。
  弃去上清液
8. 用0.5ml的PBS-T重悬沉淀。反转数次并短暂离心（400g x g，持续2-3秒）。将磁力管置于冰上3分钟。
  弃去上清液
9. 重复步骤C8，两次（总共三次）。与正常小鼠IgG结合的Dynabeads准备好了步骤E1。
制备与重组CRISPR RNP缀合的Dynabeads
1. 向管中加入2μg重组的3xFLAG-dCas9-D，其中Dynabeads与0.5ml PBS-T-BSA中的抗-FLAG抗体缀合（步骤C6）。
  在4°C旋转2-3小时
2. 短暂离心（400 g x g，持续2-3秒）。将磁力管置于冰上3分钟。
  弃去上清液
3. 用0.5ml的PBS-T重悬沉淀。反转数次并短暂离心（400g x g，持续2-3秒）。将磁力管置于冰上3分钟。
  弃去上清液
4. 重复步骤D3（总共两次）。
5. 在0.5ml体外CRISPR缓冲液（+ 0.5mM DTT）中重悬沉淀。反转数次并短暂离心（400g x g，持续2-3秒）。将磁力管置于冰上3分钟。
  弃去上清液
6. 加入100μl体外CRISPR缓冲液（+ 0.5mM DTT）和4μl程序B中制备的gRNA。
7. 37°C孵育10分钟。与重组CRISPR RNP结合的Dynabeads已准备好进行步骤E3。
亲和纯化（染色质免疫沉淀）
1. 取800μl碎片化的染色质（程序A），其对应于从2×10 7个细胞中提取的染色质，并加入到含有与正常小鼠IgG结合的Dynabeads的管中（步骤C9）。
  在4°C旋转1小时
2. 将磁力架置于冰上3分钟
3. 将澄清的上清液转移到管中，其中制备与重组CRISPR RNP缀合的Dynabeads（步骤D7）。加入RNase抑制剂（40U / ml，终浓度）。
4. 在37°C孵育20分钟，650转/分钟
5. 将磁力管置于冰上3分钟。
  弃去上清液
6. 用1毫升改良低盐缓冲液（+ 0.04％SDS）洗珠（见食谱）。在4°C旋转10分钟。将磁力管置于冰上3分钟。
  弃去上清液
7. 重复步骤E6，三次（共四次）。
8. 加入1毫升TBS-IGEPAL CA-630（见食谱）。在4°C旋转10分钟。将磁力管置于冰上3分钟。
  弃去上清液
9. 洗脱1：用60μl洗脱缓冲液重悬珠（参见食谱）。在37°C孵育20分钟，以850转/分钟的速度加热。将磁力管置于冰上3分钟。将上清转移到1.5毫升的管中。
10. 洗脱2：用40μl洗脱缓冲液重悬珠。在37°C孵育5分钟，850转/分钟，将磁力管置于冰上3分钟。将上清液转移到1.5ml管中，收集60μl洗脱液（共100μl）。
11. 加入4微升5 M NaCl（见食谱）。
  在65°C孵育过夜
12. 加入2微升10毫克/毫升的核糖核酸酶A.在37°C孵育1小时。
13. 加入5μl的10％SDS和5μl的20mg / ml蛋白酶K.在45℃孵育2小时。
14. 用ChIP DNA Clean and Concentrator（Zymo Resarch）按照生产商的方案纯化DNA（例如，可以使用试剂盒中的0.6ml的ChIP DNA结合缓冲液和60μl的洗脱缓冲液）。
NGS文库的制备和NGS分析
1. 根据制造商的协议，使用TruSeq ChIP样品制备试剂盒（Illumina）从DNA样品制备NGS文库（步骤E14）。
2. 使用HiSeq 2500系统（36 bp单端，20-50万读数）对DNA文库进行DNA测序。
3. 您可以在合适的查看器中查看NGS数据（例如，Integrative Genomics Viewer， http://software.broadinstitute.org/software/igv/IGV ）（图2和3）。
  
  图2.通过体外分离靶基因组区域 enChIP。：一种。 gRNA的目标位置; B.在目标区域周围的NGS峰值图像。 NGS数据在IGV中可视化。图2是根据Creative Commons Attribution License转载的：Fujita et al。 Locus特异性ChIP结合NGS分析揭示了与Pax5启动子物理相互作用的基因组调控区鸡B细胞系。 DNA Res 。 2017，24：537-548。
  
  图3.鉴定与Pax5启动子区域相互作用的基因组区域。与Pax5启动子区域物理相互作用的基因组区域。 NGS数据在IGV中可视化。图3根据Creative Commons Attribution License转载：Fujita et al。 Locus特异性ChIP结合NGS分析揭示了与Pax5启动子物理相互作用的基因组调控区域鸡B细胞系。 DNA Res 。 2017，24：537-548。

数据分析

为了在IGV中可视化，将NGS数据（BAM文件）上传到IGV。加载参考基因组信息（例如，，galGal4）以映射NGS数据。
放大浏览器中目标基因组区域的位置以确认目标基因组区域的分离（图2B）。用阴性对照NGS数据（ eg ， in vitro enChIP-Seq without gRNA）检查NGS数据以判断目标基因组区域的信号是否不是噪音。
在全基因组范围内查看，您可以手动确定与目标基因组区域相互作用的基因组区域（图3）。在这方面，NGS数据中检测到的峰值区域，而不是阴性对照NGS数据可以被判断为相互作用的基因组区域。使用MACS2或其他软件（Fujita等人，2017b）可自动检测每个体外的窄峰enChIP-Seq数据集。

笔记

也可以将使用CRISPR的常规“in cell”enChIP与NGS（enChIP-Seq）相结合（Fujita等人，2017b）。在这种情况下，如前所述（Fujita和Fujii，2014b和2015），在细胞中表达CRISPR组分（例如，3xFLAG-dCas9和sgRNA），并进行enChIP以分离靶基因座。分离基因座后，如步骤E12-F3所示纯化和分析DNA。
在NGS分析之前，可以通过qPCR确认目标基因组区域的分离。为此目的，DNA样品（步骤E14）用对目标基因组区域特异的引物组进行qPCR。先前显示了一些例子（Fujita等人，2016b和2017a）。
可以列出脱靶结合位点作为相互作用的基因组区域的候选物。为了消除这种潜在的脱靶位点，有必要检查候选基因组区域的DNA序列是否不含与gRNA的靶序列相似的序列。
为了增加提取相互作用的基因组区域的可靠性，在两个或更多个gRNA对相同的基因组区域进行体外 enChIP将是有用的。在这方面，使用不同的gRNA（除了靶基因组区域）通过体外芯片通常检测到的基因组区域可以被判断为真正的相互作用的基因组区域。以前描述过细节（Fujita等人，2017b）

食谱

1 M KCl溶液（50毫升）
3.73克KCl（分子量：74.55）
DDW到50毫升
0.1 M DTT溶液（10 ml）（在-20°C储存）
0.15克DTT（分子量：154.25）
DDW至10毫升
体外CRISPR缓冲液（+ 0.5mM DTT）
20 mM HEPES，pH 7.1-7.5
150 mM KCl
0.1mM EDTA
10mM MgCl 2•/ 2 0.5 mM DTT
1x蛋白酶抑制剂
准备50毫升：
1毫升1M HEPES（pH 7.1-7.5）
7.5毫升1M KCl
10μl0.5M EDTA
500μl1M MgCl 2
250μl0.1 M DTT（在使用前添加）
5片cOmplete，迷你，无EDTA（使用前添加）
41毫升DDW
PBS-T（10毫升）
PBS（pH7.4），0.01％Tween-20 10毫升PBS
10μl10％Tween-20
PBS-T-BSA
PBS（pH 7.4）
0.01％Tween-20
0.1％BSA
为了准备10毫升：
10毫升PBS
10μl10％Tween-20
133μl7.5％BSA部分V
5 M NaCl溶液（50毫升）
14.61克NaCl（分子量：58.44）
DDW到50毫升
改良低盐缓冲液（+ 0.04％SDS）
20mM Tris，pH8.0
2 mM EDTA
150 mM NaCl
0.1％Triton X-100
0.04％SDS
1x蛋白酶抑制剂
5U / ml RNA酶抑制剂
准备50毫升：
1毫升1M Tris（pH 8.0）
200μl0.5M EDTA
1.5毫升5M NaCl
50μlTriton X-100
200μl10％SDS（使用前添加）
5片cOmplete-Mini（使用前添加）

6.25μlRNasin plus（40 U / ml）（在使用前添加）
47.05毫升DDW
TBS
50 mM Tris（pH 7.5）
150 mM NaCl
为了准备10毫升：
500μl1 M Tris（pH 7.5）
300μl5M NaCl
9.2毫升DDW
TBS-IGEPAL CA-630
50 mM Tris（pH 7.5）
150 mM NaCl
0.1％IGEPAL CA-630
为了准备10毫升：
9.99毫升TBS
10微升IGEPAL CA-630
洗脱缓冲液
50 mM Tris（pH 7.5）
150 mM NaCl
0.1％IGEPAL CA-630
500μg/ ml 3xFLAG肽
准备500微升：
在TBS中加入50μl5mg / ml 3xFLAG肽
450μlTBS-IGEPAL CA-630

致谢

该协议是从以前发表的文章（藤田等人，2017a）改编的。我们感谢M. Yuno的技术援助。（C）（＃15K06895）（TF）和科学研究资助（B）（＃15H04329）（TF，HF）日本的文化，体育和科技。
T.F.和H.F.在enChIP（“使用与内源DNA序列特异性结合的分子分离特定基因组区域的方法”，专利号：日本5,954,808，专利申请号WO2014 / 125668）上有专利。 T.F.和H.F.是Epigeneron，LLC的创始人。

参考

Fujita，T。和Fujii，H。（2014a）。使用重组外源性DNA结合蛋白，通过iChIP系统高效分离保留分子间相互作用的特定基因组区域。 BMC Mol Biol 15：26.
Fujita，T。和Fujii，H。（2014b）。使用工程化的DNA结合分子识别蛋白与体内感兴趣的基因组区域相互作用介导的染色质免疫沉淀（enChIP）。 Bio Protoc 4（10）：e1124。
Fujita，T。和Fujii，H。（2015）。通过工程DNA结合分子介导的染色质免疫沉淀分离特定基因组区域和鉴定相关分子enChIP）。 Methods Mol Biol 1288：43-52。
Fujita，T。和Fujii，H。（2016a）。使用基因座特异性染色质免疫沉淀技术的基因组功能生化分析基因Regul Syst Bio 10（Suppl 1）：1-9。
Fujita，T.，Kitaura，F.，Yuno，M.，Suzuki，Y.，Sugano，S.和Fujii，H。（2017a）。基因座特异性ChIP结合NGS分析揭示了与Pax5发生物理相互作用的基因组调控区域在鸡B细胞系中的启动子。 DNA Res 24（5）：537-548。
Fujita，T.，Yuno，M.和Fujii，H。（2016b）。通过体外体外有效的序列特异性分离DNA片段和染色质 enChIP技术使用重组CRISPR核糖核蛋白。基因细胞 21（4）：370-377。
Fujita，T.，Yuno，M.，Suzuki，Y.，Sugano，S.和Fujii，H。（2017b）。通过enChIP-Seq鉴定基因组区域之间的物理相互作用基因细胞 22（6）：506-520。