材料和试剂

移液器吸头
组织培养10厘米培养皿（Greiner Bio One International，目录号：664160）
胶原蛋白涂层组织培养10厘米的菜肴（康宁，目录号：354450）
15ml锥形离心管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：339650）
Terumo注射器10-ml（Terumo，目录号：SS-10ESZ）
Terumo针21 G x1 1/2“（Terumo，目录号：NN-2138S）
MS柱（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-201）
预分离过滤器（Miltenyi Biotec，目录号：130-041-407）
组织培养48孔板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：150687）
Millex-GV 0.45-μmPVDF 33毫米无菌注射器过滤器（Merck，目录号：SLHV033RB）
Terumo结核菌素注射器26G×1/2“（Terumo，目录号：SS-01T2613S）
Terumo Myjector胰岛素注射器29 G x 1/2“（Terumo，目录号：SS-05M2913）
Terumo注射器1-ml（Terumo，目录号：SS-01T）
Terumo针18 G x1½“（Terumo，目录号：NN-1838S）
组织培养12孔板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：150628）
瓶顶过滤器0.2-μmPVDF（Corning，目录号：431098）
五周龄雌性C57BL / 6JJcl小鼠（供体小鼠）（CLEA日本，东京，日本）
七周龄雌性C57BL / 6JJcl小鼠（受体小鼠）（CLEA日本）
Platinum-E包装（PLAT-E）细胞系（Morita等，2000）（由Toshio Kitamura博士或Cell Biolabs，产品目录号：RV-101提供）
WEHI-3（ATCC，目录号：TIB-68）
pMSCV-neo载体（Takara Bio，Clontech TM，目录号：634401）
pMSCV-neo-MLL-ENL（请求横滨明彦： ayokoyam@ncc-tmc.jp ）
胰蛋白酶-EDTA溶液（NACALAI TESQUE，目录号：32778-34）
Lipofectamine TM 2000转染试剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：11668019）
Opti-MEM TM I培养基（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：31985070）。
70％乙醇
CD117微珠，小鼠（Miltenyi Biotec，目录号：130-091-224）
2.5％Baytril溶液（Bayer，Baytril TM，， https ：//www.baytril.com/en/farm-animals/product/oral/ ）
Polybrene感染/转染试剂（10 mg / ml）（Merck，目录号：TR-1003-G）
Bambanker无血清冷冻培养基（NIPPON Genetics，目录号：BB01）
G418解决方案（NACALAI TESQUE，目录号：16513-84）
氯化钠（NaCl）（NACALAI TESQUE，目录号：31320-05）
Na 2 HPO 4•12H 2 O（Wako Pure Chemical Industries，目录号：196-02835）。
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：164-22635）
氯化钾（KCl）（和光纯药工业，目录编号：160-22115）
胎牛血清（FBS）（NICHIREI，Sigma-Aldrich，目录号：172012-500ml）
青霉素 - 链霉素 - 谷氨酰胺（P / S）溶液（NACALAI TESQUE，目录号：06168-34）
达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）（NACALAI TESQUE，目录号：08459-64）
RPMI 1640（NACALAI TESQUE，目录号：30264-56）
乙二胺四乙酸（EDTA）（NACALAI TESQUE，目录号：15130-95）
氢氧化钠（NaOH）（和光纯药工业，目录号：198-13765）
氯化铵（NH4Cl）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：017-02995）
碳酸氢钾（KHCO 3）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：166-03275）
牛血清白蛋白（BSA）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：019-23293）
鼠干细胞因子（SCF）（PeproTech，目录号：250-03）
鼠白细胞介素-3（IL-3）（PeproTech，目录号：213-13）
鼠白细胞介素-6（IL-6）（PeproTech，目录号：216-16）
鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）（PeproTech，目录号：315-03）
IMDM粉末（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：12200036）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：195-14515）
甲基纤维素（粘度：4000cP）（Sigma-Aldrich，目录号：M0512）
β-巯基乙醇（NACALAI TESQUE，目录号：21418-84）
戊巴比妥钠（NACALAI TESQUE，目录号：02095-04）
25X磷酸盐缓冲盐水Ca2 + / Mg2 + / PBS（见食谱）
D10媒体（见食谱）
R10媒体（见食谱）
R10W10媒体（见食谱）
0.5M EDTA溶液（见食谱）
ACK裂解缓冲液（见食谱）
SM缓冲区（见食谱）
细胞因子库存（见食谱）
交流媒体（见食谱）
麻醉解决方案（见食谱）

设备

移液器P2，P20，P200，P1000
5％CO 2培养箱37℃
5％CO 2培养箱32°C
离心15毫升锥形管
细胞计数器（血细胞计数器）
层流柜
手术剪刀和钳子
MACS多中心（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-303）
MiniMACS分离器（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-102）
Portable Pipet-Aid XP移液管控制器（Drummond Scientific，目录号：4-000-101）
-80°C冰箱
1升玻璃瓶
高压灭菌器
摇床
具有铯-137的Gammacell40反应器（Best Theratronics，型号：Gammacell40）
一般细胞培养倒置显微镜

软件

GraphPad Prism（GraphPad Software，La Jolla，CA，USA）

程序

附表：
第1天开始从冷冻原料培养PLAT-E细胞第4天。Replate PLAT-E细胞转染
第5天。转染PLAT-E细胞
第6天c-kit阳性细胞的制备和小鼠的照射
第7天。逆转录病毒转导到c-kit阳性细胞和注射液注意：

制备每个样品的供体小鼠（5周龄雌性C57BL / 6J小鼠）和5只受体小鼠（7周龄雌性C57BL / 6J小鼠）。
本实验需要一个阳性对照（MLL-ENL）和一个阴性对照（空载体; pMSCV-neo）。

病毒制备
1. 在第1天，用冷冻原液融化4×10 6个PLAT-E细胞并用D10培养基在10cm培养皿中培养（参见食谱）。初始培养需要移除冷冻培养基。
  注意：文化大小取决于样本大小。
2. 在第4天，在10毫升D10培养基中的两个10厘米胶原包被的培养皿中重新铺板4×10 6 PLAT-E细胞作为样品。详细地说，删除培养基，加入10毫升的PBS，删除PBS，加入1毫升胰蛋白酶-EDTA和孵化5分钟在37°C 5％CO 2培养箱。加入9ml的D10培养基，转移到15ml的试管中，在室温下400×g离心5分钟，然后除去上清液。加入10毫升的D10培养基，计数细胞数量，并用10毫升的D10培养基样品在两个10厘米胶原蛋白包被的培养皿中重新铺板4×10 6个PLAT-E细胞。 />
3. 在第5天，用16μgDNA和40μlLipofectamine TM 2000转染试剂转染PLAT-E细胞。转染时，细胞汇合度应为60-70％。详细地，在1ml Opti-MEM TM培养基中稀释16μgDNA，并在1ml Opti-MEM中稀释40μlLipofectamine TM 2000转染试剂> TM媒体，分开。 5分钟后，将DNA溶液与Lipofectamine TM 2000溶液合并。轻轻混合并在室温下孵育20分钟。将DNA-Lipofectamine混合物添加到每个培养皿中，并在37℃，5％CO 2培养箱中孵育。 6小时后，用新鲜的D10培养基更换培养基，并在32°C 5％CO 2培养箱中培养2天。
制备c-kit（CD117）阳性祖细胞
1. 在第6天，通过颈椎脱臼对5周龄雌性C57BL / 6J小鼠实施安乐死，在室内全身喷洒70％乙醇，并在层流柜中将供体小鼠的股骨和胫骨解离（图1）。
  应尽可能彻底地用外科手术剪去除外周肌肉。
  注意：以下过程中描述的解决方案的体积是来自一个供体小鼠的细胞。如果温度没有特别说明，所有的程序应该在室温下进行。
  
  图1.小鼠胫骨和股骨的说明性图像
2. 切割股骨和胫骨的末端，并用10毫升的PBS冲洗骨髓（见食谱），使用附带21 G针的10毫升注射器（图2）。
  
  图2.从胫骨和股骨中分离骨髓细胞
3. 轻轻匀化骨髓细胞，使其通过21G针头
4. 将细胞以400×g离心5分钟，然后尽可能多地除去上清液。
5. 重悬细胞在1毫升的ACK裂解缓冲液（见食谱），并在冰上孵育1分钟。
6. 加入10毫升R10W10培养基（见食谱），并将细胞在400×g下旋转5分钟，然后除去上清液。
7. 将细胞重悬于10ml SM缓冲液中（参见食谱）并在400×g下旋转5分钟，然后除去上清液。
8. 用0.5 ml SM缓冲液重悬细胞，加入20μlCD117微珠，在冰上或冰箱中孵育20分钟。
9. 加入10ml的SM缓冲液并在400×g下离心5分钟，然后取出上清液洗涤细胞。
10. 按照步骤B9再次清洗细胞。
11. 在MACS磁架上安装MS列
12. 从磁力架上取下柱子，放在新的15毫升锥形管上。
13. 向柱中加入1 ml SM缓冲液，通过重力流动（任选使用活塞）洗脱c-kit阳性细胞。
14. 加入10ml的R10W10培养基，并在400×g下离心5分钟，然后除去上清液。
15. 重悬1毫升R10W10中的所有细胞，并将细胞转移到48孔板中的一个孔中。
16. 加入细胞因子（10ng / ml SCF，10ng / ml IL-3,10ng / ml终浓度的IL-6）并将细胞在37℃5％CO 2培养箱过夜。
照射小鼠
1. 在第7天，在γ-细胞中以亚致死剂量（6Gy）照射受体小鼠。
  几个小鼠可以同时使用单独分离的笼子进行照射
2. 添加1毫升的2.5％的拜耳剂溶液到200毫升的饮用水中，并处理1周。在一周的治疗过程中，含有Baytril的水不一定会发生变化。
病毒转导
1. 在第7天，计数细胞。预计来自供体小鼠的总共1-2×10 6个c-kit阳性细胞。
2. 加入适量的R10W10培养基，制成6×10 5个细胞/ ml悬浮液，加入1/250体积的10mg / ml聚凝胺溶液。
3. 将1毫升细胞悬液分装到15毫升锥形管中（每个样品两个管）。
4. 用10ml注射器吸取10ml来自PLAT-E细胞培养物的病毒上清液，将过滤器（0.45μm）连接到10ml注射器上，并将病毒上清液直接加到c-kit阳性细胞暂停。
5. 在32℃下将细胞悬浮液在1,100×g下旋转2.5小时（Spinoculation）。
6. spinoculation后，删除病毒上清液，并用10毫升PBS洗两次细胞。
7. 将细胞重悬于PBS中2×10 5个细胞/100μl。
  注：注射的细胞数量影响白血病发生的持续时间和发生率。因此，我们可以在一定程度上通过减少/增加细胞数量来控制持续时间。
8. 将细胞悬液放在冰上，直到注射。
移植
1. 用结核菌素注射器腹膜内注射300μl的麻醉溶液（见食谱）。
  小鼠将在5分钟内完全麻醉，并保持睡眠1小时。
2. 5分钟后，使用Myjector胰岛素注射器将100μl细胞悬液注入眶后窦。将眼睛放开，将眼睛和皮肤之间1-2毫米深的针头朝着大脑放置到静脉，轻轻地注射细胞悬液（图3）（Yardeni et al。，2011 ）。
  注意：或者，尾静脉注射适用，而不是眼眶后注射
3. 将老鼠放入笼子中进行恢复和监测。
  
  图3.小鼠的眼球后注射
肿瘤细胞分离和培养
1. 当小鼠表现出病态的外观时，以与骨髓制备相同的方法（步骤B1-B6），牺牲小鼠并从股骨和胫骨解离肿瘤细胞。可选地，分离脾进行病理分析。
  注意：病态的外观表明减肥，皮毛不好的状况，以及对刺激的最小反应，例如用指尖刺激和戳动。在第一次移植中从第60天到第140天可以正常观察，在第二次移植中从第20天到第50天可以正常观察到。
2. 用步骤B2-B6中描述的ACK缓冲液处理制备骨髓细胞悬液
3. 添加1毫升的R10W10媒体，并计算细胞数量。
4. 加入适量的R10W10培养基，制成5×10 5个细胞/ ml悬浮液。
5. 分装200μL的细胞悬液，添加1毫升交流媒体（见食谱）使用1毫升注射器连接18 G针，并涡流混合。可选地，残留细胞可以被储存。详细地，将细胞在400×g下旋转5分钟，然后除去上清液。在冷冻介质中重悬细胞（我们通常使用Bambanker冷冻溶液，但也可以使用R10W10加10％DMSO），并直接储存在-80°C。对于长期储存，储存管应从-80°C冷冻机转移到液氮中。
6. 加入20μl的G418溶液以消除正常细胞，并在37℃5％CO 2培养箱中培养5天。
7. 使用带有18G针的1-ml注射器将细胞转移至12孔板中，并在37℃的5％CO 2培养箱中孵育几天。在培养过程中，准备受体小鼠进行二次移植。如果由于细胞过多而使培养基变成橙色，则添加1ml含G418的AC培养基。
  注：保持良好的文化条件是重要的。过度生长大大影响了第二次移植中白血病的发病率。
二次移植
1. 用10ml PBS收集细胞，转移到15ml锥形管中，并在400×g下旋转5分钟。
2. 去除上清液，重悬细胞在10毫升的PBS，并删除碎片通过预分离过滤器。
3. 计数细胞数量并将细胞重悬于PBS中2×10 5个细胞/100μl。
  注：注射的细胞数量影响白血病发生的持续时间和发生率。因此，我们可以在一定程度上通过减少/增加细胞数量来控制持续时间。
4. 将细胞悬液放在冰上。
5. 注射结核菌素注射器腹腔注射300μl的麻醉剂
6. 用Myjector胰岛素注射器将100μl细胞悬液注入眶后窦。
7. 将老鼠放入笼中进行恢复和监测。
  注：与初次移植相比，二次移植的存活时间缩短（图4）。这可能是因为白血病细胞在第一次发病时需要获得遗传/表观遗传改变。或者，与初次移植相比，在二次移植时癌症干细胞/起始群体可能更富集。目前还不清楚为什么在第二次移植中，持续时间已经大大缩短。
  
  图4.该模型中MLL-ENL的致白血病潜能

数据分析

我们通常每个样品使用五只受体小鼠至少进行两次这个实验。在两个独立实验中，每个样品共需要10个受体小鼠进行初级移植。为了确认白血病的发生能力，五个受体小鼠通常移植原代白血病细胞。
为了生存分析，我们使用GraphPad Prism软件。为了比较两个数据集，我们使用Log-rank方法。为了比较三个或更多的数据集，我们使用Gehan-Breslow-Wilcoxon测试。

食谱

（PBS）（1L）的25x磷酸盐缓冲盐水Ca 2 + / Mg 2+ /
1. 混合200g NaCl，72.4g Na 2 HPO 4•12H 2 O，5g KH 2 PO 4， 4克和5克KCl
2. 用蒸馏水调至1L
3. 在121°C高压灭菌20分钟
4. 用蒸馏水稀释至1x以获得工作溶液
D10媒体

加入55毫升FBS和5.5毫升P / S溶液到500毫升DMEM中
R10媒体
加入55毫升的FBS和5.5毫升的P / S溶液到500毫升的RPMI 1640
R10W10媒体
1. 在R10培养基中培养WEHI-3至融合
2. 当介质变成橙色时，收集并过滤介质（0.22μm）
3. 分装和存储在-80°C
4. 加入55毫升FBS，55毫升WEHI-3培养基，5.5毫升P / S溶液到500毫升RPMI 1640中。
0.5M EDTA溶液
1. 称重93.06 g EDTA
2. 用蒸馏水调至1升，用NaOH调节pH至8.0
ACK裂解缓冲液
1. 混合8.29克NH 4 Cl和1克KHCO 3。
2. 用蒸馏水加1升
3. 加200μl的0.5M EDTA溶液
4. 过滤（0.2-μm）并在4°C储存
SM缓冲区
1. 加入15 ml FBS到500 ml 1x PBS中
2. 过滤（0.2-μm）并在4°C储存
细胞因子库存
1. 将10mg的BSA粉末溶解在10ml的PBS中并过滤（0.2-μm）（PBS + 0.1％BSA）
2. 用PBS + 0.1％BSA将细胞因子（SCF，IL-3，IL6，GM-CSF）溶解到50μg/ ml。
3. 分装和存储在-80°C
AC媒体
1. 用500毫升蒸馏水溶解IMDM粉末，加入3克NaHCO 3和过滤器（0.2微米）
2. 在1升玻璃瓶中称量16克甲基纤维素
3. 在121℃高压灭菌甲基纤维素粉20分钟
4. 用300毫升无菌水和500毫升IMDM在摇床中溶解无菌甲基纤维素
5. 加200毫升的FBS和7微升的β-巯基乙醇
6. 分装和存储在-20°C
7. 使用前，加20μLSCF，20μLIL-3,20μLGM-CSF和1ml P / S溶液
麻醉解决方案
1. 使用前用PBS稀释10倍的戊巴比妥钠溶液
2. 戊巴比妥钠的最终浓度应为5 mg / ml

致谢

这项研究得到了JSPS KAKENHI对H.O.的资助。（编号17H07379）和A.Y. （编号16H05337）。该协议基于Lavau et al。（1997）的先前报道。作者宣称没有利益冲突。

参考

Andersson，AK，Ma，J.，Wang，J.，Chen，X.，Gedman，AL，Dang，J.，Nakitandwe，J.，Holmfeldt，L.，Parker，M.，Easton，J.，Huether， R.，Kriwacki，R.，Rusch，M.，Wu，G.，Li，Y.，Mulder，H.，Raimondi，S.，Pounds，S.，Kang，G.，Shi，L.，Becksfort， J.，Gupta，P.，Payne-Turner，D.，Vadodaria，B.，Boggs，K.，Yergeau，D.，Manne，J.，Song，G.，Edmonson，M.，Nagahawatte，P.， Wei，L.，Cheng，C.，Pei，D.，Sutton，R.，Venn，NC，Chetcuti，A.，Rush，A.，Catchpoole，D.，Heldrup，J.，Fioretos，T.，Lu Downing，JR和St. Jude儿童研究医院的研究人员发现了一种新的治疗方法，华盛顿大学儿科癌症基因组，P.（2015）。婴儿MLL重排急性淋巴细胞白血病体细胞突变的情况 Nat Genet 47（4）：330-337。
Ayton，P.M。和Cleary，M.L。（2003）。 MLL癌蛋白对骨髓祖细胞的转化依赖于Hoxa7和Em > Hoxa9 。 Dev 17：2298-2307。
Jude，C. D.，Climer，L.，Xu，D.，Artinger，E.，Fisher，J.K。和Ernst，P。（2007）。 MLL在成人造血干细胞和祖细胞中独特而独立的作用细胞干细胞 1（3）：324-337。
Lavau，C.，Szilvassy，S.J。，Slany，R.和Cleary，M.L。（1997）。逆转录病毒转导的HRX-ENL对骨髓单核细胞前体的永生化和白血病转化。 > EMBO J 16（14）：4226-4237。
Meyer，C.，Burmeister，T.，Groger，D.，Tsaur，G.，Fechina，L.，Renneville，A.，Sutton，R.，Venn，NC，Emerenciano，M.，Pombo-de-Oliveira， MS，Barbieri Blunck，C.，Almeida Lopes，B.，Zuna，J.，Trka，J.，Ballerini，P.，Lapillonne，H.，De Braekeleer，M.，Cazzaniga，G.，Corral Abascal，L. ，Van der Velden，VHJ，Delabesse，E.，Park，TS，Oh，SH，Silva，MLM，Lund-Aho，T.，Juvonen，V.，Moore，AS，Heidenreich，O.，Vormoor， Zerkalenkova，E.，Olshanskaya，Y.，Bueno，C.，Menendez，P.，Teigler-Schlegel，A.，Zur Stadt，U.，Lentes，J.，Gohring，G.，Kustanovich，A.，Aleinikova， O.，Schafer，BW，Kubetzko，S.，Madsen，HO，Gruhn，B.，Duarte，X.，Gameiro，P.，Lippert，E.，Bidet，A.，Cayuela，JM，Clappier， Alonso，CN，Zwaan，CM，van den Heuvel-Eibrink，MM，Izraeli，S.，Trakhtenbrot，L.，Archer，P.，Hancock，J.，Moricke，A.，Alten，J.，Schrappe，M. ，Stanulla，M.，Strehl，S.，Attarbaschi，A.，Dworzak，M.，Haas，OA，Panzer-Grumayer，R.，Sedek，L.，Szczepansk i，T.，Caye，A.，Suarez，L.，Cave，H.和Marschalek，R.（2017）。 2017年急性白血病的MLL重组。白血病。
Morita，S.，Kojima，T。和Kitamura，T。（2000）。 Plat-E：一种高效稳定的逆转录病毒瞬时包装系统 Gene Ther 7（12）：1063-1066。
Okuda，H.，Kanai，A.，Ito，S.，Matsui，H.和Yokoyama，A。（2015）。 AF4使用RNAP1机制的SL1组分启动MLL融合和AEP依赖性转录。 a> Nat Commun 6：8869.
Okuda，H.，Kawaguchi，M.，Kanai，A.，Matsui，H.，Kawamura，T.，Inaba，T.，Kitabayashi，I.和Yokoyama，A。（2014）。 MLL融合蛋白将转录共激活因子与之前活跃的富含CpG的启动子相连接。 Nucleic Acids Res 42（7）：4241-4256。
Okuda，H.，Stanojevic，B.，Kanai，A.，Kawamura，T.，Takahashi，S.，Matsui，H.，Takaori-Kondo，A。和Yokoyama，A。（2017）。 AF4和DOT1L合作基因激活驱动MLL重排的白血病 J Clin Invest 127（5）：1918-1931。
Okuda，H.，Takahashi，S.，Takaori-Kondo，A.和Yokoyama，A。（2016）。 AF4通过SL1加载TBP是MLL融合依赖性转录的主要限速步骤。 / a> Cell Cycle 15（20）：2712-2722。
Somervaille，T.C。和Cleary，M.L。（2006）。小鼠MLL-AF9急性髓性白血病中白血病干细胞的鉴定和表征 Cancer Cell 10（4）：257-268。
Yardeni，T.，Eckhaus，M.，Morris，H. D.，Huizing，M.和Hoogstraten-Miller，S.（2011）。老鼠的复古轨道注射 Lab Anim （纽约） 40（5）：155-160。
Yokoyama，A.，Ficara，F.，Murphy，M.J.，Meisel，C.，Hatanaka，C.，Kitabayashi，I.和Cleary，M.L。（2013）。 MLL通过分子内相互作用而不是通过蛋白水解加工而起作用 PLoS一个 8（9）：e73649。
Yokoyama，A.，Lin，M.，Naresh，A.，Kitabayashi，I.和Cleary，M.L。（2010）。包含AF4和ENL家族蛋白与P-TEFb的高级复合物促进致癌和生理MLL-依赖的转录。癌症细胞 17（2）：198-212。