材料和试剂

15和50毫升无菌猎鹰管。锥形离心管（Corning，Axygen ，目录号：SCT-15ML-500; SCT-50ML-500）
巴斯德移液器
一次性（90毫米直径）培养皿（BD，目录号：252777）
纤维素滤纸0.22μm（Merck，目录号：GSWP04700）
将枯草芽孢杆菌菌株YB955（hisC952 metB5 leuC427xin-1spββsiem）和PERM1017（ hisC952 metB5 leuC427 n nrdE :: lacZ spac-nrdEF :: ery Ery r ）
Penassay肉汤（PAB;抗生素培养基3; Difco Laboratories，Sparks，MD）（Fisher Scientific目录号：DF0243-17-8）
制造商：BD，目录号：B224320。
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）（Promega，目录号：V3951）
L-亮氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：L8000）
L-谷氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：49449）
L-异亮氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：58879）
L-甲硫氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：M9625）
L-组氨酸单盐酸盐一水合物（Sigma-Aldrich，目录号：53370）
硫酸铵（（NH 4）2 SO 4）（Karal，目录号：3016）
磷酸二氢钾（K 2 HPO 4）（Karal，目录号：5080）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Karal，目录号：5079）
柠檬酸钠（C 6 H 5）Na 3 O 7•2H 2 O ）（Avantor Performance Materials，JT Baker ®，目录号：3646-01）
硫酸镁七水合物（MgSO4•7H2O）（Karal，目录号：6056）
氯化镁六水合物（MgCl 2•6H 2 O）（Karal，目录号：6054）
氯化钙二水合物（CaCl 2•2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C2536）
注：此产品已停产。
氯化亚铁四水合物（FeCl 2•4H 2 O）（Avantor Performance Materials，JT Baker，目录号：2064-01） />
氯化锌（ZnCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：Z0152）
氯化铜（II）二水合物（CuCl 2•2H 2 O）（Karal，目录号：8021）
氯化钴（II）六水合物（CoCl 2•6H 2 O）（Karal，目录号：8026）
脱水钼酸钠（Na 2 MoO 4•2H 2 O）（Karal，目录号：4072）
琼脂（BD，目录号：215000）
葡萄糖（BD，目录号：216800）
PAB培养基（PAB）（见食谱）
氨基酸溶液（见食谱）
1 M IPTG（见食谱）
10倍Spizizen盐（10倍不锈钢）
100倍微量元素（见食谱）
Spizizen最低盐（SS）（见食谱）
Spizizen基本培养基（SMM）（见食谱）
软琼脂（见食谱）

设备

轨道振荡器Lab-Line MaxQ 4000（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：MaxQ TM 4000）
传统的培养箱设置在37°C
分光光度计（Biochrom，型号：WPA CO7500）
离心机Thermo Scientific IEC CL30R（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：IEC CL30R）
常规高压灭菌器
125毫升无菌锥形瓶
可重复使用的注射器过滤器支架（Merck，产品目录号：SX0002500）
磁力搅拌棒

程序

细胞繁殖
1. 繁殖1:50稀释的过夜培养物。在25ml的PAB培养基（补充有0.1mM IPTG，如果需要的话，参见食谱）中培养枯草芽孢杆菌菌株。剧烈摇动（250转/分钟）37°C孵育，通过设置在600纳米的分光光度计定期读数监测生长。
2. 在半对数表中绘制OD 600nm与时间的关系曲线，并确定时间零点（T 0），定义为培养时间点，当对数和增长拦截的固定阶段（请参阅补充图S1 ）。
3. 在T 0分钟后90分钟，将10ml培养物转移到无菌的15ml Falcon管中并离心（4,800×g; 10分钟，23℃）。每次用10ml 1x SS洗涤细胞沉淀3次（见食谱），并重新悬浮在相同体积的同一溶液中。
可行的计数
通过在1×SS中制备系列十倍稀释液，在补充有组氨酸，甲硫氨酸的SMM上的10 -5至10 -7的平板接种稀释液中确定每种菌株的初始细菌数量和亮氨酸，在37℃孵育48小时，并计算每毫升CFU的数量。
选择压力
1. 取1毫升细胞悬液的等分试样，并独立地转移到含有49毫升软琼脂SA（一个SA1和两个SA2）的50ml Falcon管中，预热到42℃。
2. 将4ml的最终混悬液分别注射到12个SMM-His-Leu-2平板和24个SMM-Met-Leu-允许固化并在37℃孵育平板10天。值得注意的是，用1mM IPTG补充平板以在菌株B中激活 nrdEF 表达。枯草杆菌 PERM1017。
  除了缺少三个氨基酸（His - ，Leu > ， - ）不用于避免有利的抑制突变同时还原His和Met营养缺陷（Sung和Yasbin，2002）。
注意：接种软琼脂（SA）有助于维持细胞固定;从而避免程序D（菌落生长）期间菌落扩散。
菌落生长
1. 在第2,4,6,8和10天期间，挑选两个His-Leu-Medium培养板和四个Met-Leu-Leu培养板（SA3），Met（SA4）或Leu - ，进行软琼脂准备以获得His- >（SA5）媒体（请参阅食谱）。在这些SMM板上倒出第一个覆盖细胞，第二个覆盖的选择性培养基（图1和图2）。 docx“target =”_ blank“>补充图S2 ）。这导致单氨基酸丢失介质选择His +，Met +或Leu +回复体。在37℃孵育平板，并记录48小时后出现的回复突变体His +，Met +，和Leu + +集落的数目孵化。
2. 确定在各自选择性培养基中使用的两个平板在各自培养日的平均回复物数量;
  使用累计回复次数和CFU数量来计算突变频率
  
  图1.固定相诱变软琼脂覆盖测定的步骤A.细胞繁殖。在PAB培养基中培养枯草芽孢杆菌菌株PERM1017，YB955和PERM1202，直到指数生长结束后90分钟;用1x SS洗。 B.可行的计数，菌落形成单位通过连续十倍稀释确定。 C.选择压力。使用相应的软琼脂覆盖物（SA1或SA2）将细胞铺在选择性培养基上并在37℃孵育10天。 D.殖民地增长。将第二个软琼脂覆盖层（SA3，SA4或SA5）加入到每个选择性培养基的一组平板中以恢复缺失的氨基酸之一，回复His +，Met +在培养48小时后对Leu +菌落进行评分。 E.在第2,4,6,8和10天期间从选择SMM-His-Leu-2和SMM-Met-2进行细胞存活的监测。如程序E中所述。在菌株PERM1017的情况下，培养基必须补充有1mM IPTG，如程序中所示（在第2,4,6,8,10天， 8和10）（Pybus et al。，2010）。
细胞存活
1. 确定具有不同基因型的菌株在SMM-His-Leu-sup或SMM-Met-Leu-在实验的十天期间，
2. 使用无菌巴斯德吸液管，在第2,4,6和8天，从用于“选择性压力”（程序C）的培养基平板的无菌区域移除三个琼脂塞。这个程序允许定量在潜伏期存活的非回复细胞的初始铺板部分。
3. 将塞子悬浮于400μl1x SS中，彻底涡旋，在含有所有必需氨基酸（50μg/ ml）的SMM上进行系列十倍稀释。
  在37°C孵育48小时后，对菌落数进行评分

注意：一个具有代表性的例子在 Table S1 。这些数据来自SPM的实验，使用软琼脂覆盖菌株枯草芽孢杆菌YB955中的hisC等位基因。

数据分析

在此过程之后，图2显示了在亲代菌株YB955中的His +，Met +和Leu + +回复物的积累，以及在条件性RNR菌株（PERM1017），在诱导（+ IPTG）或不（IPTG）条件下，nrdEF操纵子的表达。

（A），Met（强），强（强），强（强）（B）和Leu + （C） EM>的 B中。如方法中所述测定YB955（灰色方块），PERM1017 [（条件RNR品系）（+ IPTG;黑色方块）] PERM1017（-IPTG;白色方块）数据代表来自两个单独测试的平均数±标准差，对于菌株YB955和PERM1017（-IPTG）所呈现的数据报道于：Castro-Cerritos，KV，Yasbin，RE，Robleto，EA和Pedraza-Reyes，M. 2017年）。核糖核苷酸还原酶的作用枯草芽孢杆菌 “压力相关的诱变”。J Bacteriol 199（4）。

食谱

PAB培养基（PAB）
将1.75g PAB培养基溶于100ml dH 2 O，121℃高压灭菌器中15分钟。
氨基酸溶液[5毫克/毫升]
将250mg所需氨基酸溶于50ml ddH 2 O中通过过滤消毒
1 M IPTG
将1.19g IPTG溶解于5ml ddH 2 O中并通过过滤灭菌。
10倍Spizizen盐（10倍不锈钢）
解散：
10克（NH 4）2 SO 4 4/4> 70克K 2 HPO 4 4克/克 30克KH 2 PO 4 4克/克 5克柠檬酸钠•2H 2 O
1克MgSO 4•7H 2 O 0 加入ddH 2 O至500毫升
在121°C高压灭菌15分钟
100x微量元素
解散：
1.28克MgCl2•6H2O 2 O. 0.055克CaCl 2 2/2 0.135克FeCl 2•6H 2 O 0 0.01克ZnCl 2 2/2 0.0043克CuCl 2•2H 2 O 0 0.006克CoCl 2•6H 2 O 0 0.006g Na 2 MoO 4•2H 2 O
加入ddH 2 O至100毫升
在121°C高压灭菌15分钟
Spizizen基本介质（SMM）
在1升锥形瓶中：
将7.5克琼脂加入430毫升蒸馏水中，加一个磁力搅拌棒
在121°C高压灭菌15分钟
加入50毫升无菌10x SS
在恒定搅拌下冷却至50-55°C 在恒定的搅拌下加入5ml 0.5g / ml右旋糖和下列氨基酸溶液的混合物：
1. 对于培养基补充组氨酸，甲硫氨酸和亮氨酸：
  5毫升5毫克/毫升异亮氨酸
  5毫升5毫克/毫升谷氨酸
  5毫升5毫克/毫升甲硫氨酸
  5毫升5毫克/毫升组氨酸
  5毫升5毫克/毫升亮氨酸
2. 对于缺乏组氨酸和亮氨酸（SMM-His→Leu→ - ）的培养基来说：
  5毫升5毫克/毫升异亮氨酸
  5毫升5毫克/毫升谷氨酸
  5毫升5毫克/毫升甲硫氨酸
  20μl5mg / ml组氨酸
  20μl的5mg / ml亮氨酸
3. 对于缺乏甲硫氨酸和亮氨酸（SMM-Met-Leu-）的培养基来说：
  5毫升5毫克/毫升异亮氨酸
  5毫升5毫克/毫升谷氨酸
  5毫升5毫克/毫升组氨酸
  20微升5毫克/毫升甲硫氨酸
  20μl的5mg / ml亮氨酸
注：对于菌株枯草芽孢杆菌PERM1017，用1mM IPTG补充三种培养基。
倒：
1. 4.0毫升的SMM-His-Leu-2分成12个（90×15毫米）培养皿。
2. 在24（90×15mm）培养皿中加入4.0ml SMM-Met-Leu-
用于细胞接种的软琼脂培养基（SMA）
1. 0.7％琼脂
  在一个带磁力搅拌棒的1L锥形瓶中加入1.4g琼脂到200ml水中，121℃高压灭菌15分钟。
注意：在50毫升猎鹰管准备下列混合物：
1. 对于培养基中缺乏组氨酸和亮氨酸（His→Leu→中等; SA1）：
  5毫升10x SS
  500μl的5mg / ml异亮氨酸
  500微升5毫克/毫升的谷氨酸
  500微升5毫克/毫升甲硫氨酸
  500微升的0.5克/毫升葡萄糖
2. 对于缺乏甲硫氨酸和亮氨酸（Met-Leu-Medium，SA2）的培养基：
  5毫升10x SS
  500μl5mg / ml异亮氨酸
  500微升5毫克/毫升谷氨酸
  500微升5毫克/毫升组氨酸
  500μl0.5μg/ ml右旋糖
注意：
1. 在枯草芽孢杆菌PERM1017的情况下，用1mM IPTG补充培养基。
2. 将预热的琼脂（50-55℃）加入每个管中的最终体积为50ml;轻轻搅拌。
软琼脂可以获得His-sup，Met-sup或Leu-sup-media
1. 在磁力搅拌棒的烧瓶中加入350毫克琼脂到50毫升水中，121℃高压灭菌15分钟。
注意：在15ml Falcon管中准备以下混合物：
1. 对于他的 - 中等（SA3）：
  1毫升的10倍SS
  1毫升5毫克/毫升亮氨酸
  100μl的5mg / ml异亮氨酸
  100微升5毫克/毫升谷氨酸
  100微升5毫克/毫升甲硫氨酸
  100μl的0.5g / ml右旋糖
2. Met - 中（SA4）：
  1毫升的10倍SS
  1毫升5毫克/毫升组氨酸
  100μl的5mg / ml异亮氨酸
  100微升5毫克/毫升谷氨酸
  100μl的5毫克/毫升亮氨酸
  100微升0.5克/毫升右旋糖
3. 对于Leu - 中等（SA5）：
  1毫升10x SS
  1毫升5毫克/毫升甲硫氨酸
  100μl的5mg / ml异亮氨酸
  100微升5毫克/毫升谷氨酸
  100μl的5mg / ml组氨酸
  100μl的0.5g / ml右旋糖
注意：
1. 在枯草芽孢杆菌PERM1017的情况下，必须向混合物中加入100μl1M IPTG以达到1mM的最终浓度（考虑到培养皿中终体积为50ml）。
2. 加入预热的琼脂（50-55℃）至每管10ml的最终体积;轻轻搅拌。

致谢

这项工作得到墨西哥Consejo Nacional de Ciencia yTecnología（CONACYT;赠款205744和221231）和瓜纳华托大学（赠款936-2016和1090-2016）对M.P-R的支持。急诊室的工作得到了美国国立卫生研究院的资助（R15GM110624）的支持。 KV。 C-C和N.V-N得到了来自CONACYT的奖学金的支持。作者宣称没有利益冲突。

参考

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