材料和试剂

岩棉/矿棉（请参阅 http://en.wikipedia.org/wiki/Rock_wool ; 可从水栽法供应商获得）
GR24,10mM在100％丙酮中，储存在-20℃冰箱中（有限的可用性;可购自Chiralix： http://www.chiralix.com/rightclick.cfm?id=61574 ）
丙酮
MilliQ水
Ca（NO 3）/2。
KNO ₃
NH 4 3
MgSO 4。。 O
KH ₂ PO ₄
KCl
H ₃ BO ₃
MnCl 2 ^。 4H O
ZnSO 4 ^。 7 H O
CuSO 4 ^。 5 H O
CoCl <2> ^。 6 H <2> O
（NH 4）6 Mo 7 SubO 24。 2 O
Fe-EDTA
2-（N-吗啉代）乙磺酸，缓冲剂（MES）
0.5x Hoagland营养液（pH5.9）（见配方）
Hoagland的解决方案（参见配方）

设备

受控环境生长室或房间
用于生长植物的密封塑料盒，具有透明盖并且具有保持1.5ml微量离心管，例如澳大利亚新南威尔士州Astral科学公司的I5100-43的微量离心管。也可从：
http://www.bioexpress.com /divinity-cart/item/502100/GeneMate-Floater-Microtube-Rack/1.html
http://www.labsource.com/Catalog/Group.aspx?GroupID=1455
黑色1.5ml微量离心管（不透明管使光传播最小化，因此藻类生长）
细镊子
软木bore，直径8毫米，用于生产岩棉圆柱（见 http://en.wikipedia.org/wiki/Cork_borer ）

图1。三周龄拟南芥使根据本协议在水培法中种植的植物。盒子的盖子已在此照片中删除。网格正方形为1厘米。

程序

计划实验需要多少植物。如果你使用上面建议的塑料盒，你可以舒适地适合4成年植物在一个锅（见图1）。如果每个罐计为一个重复，并且你想要四个生物复制，那么你将需要每个处理4个盆（16植物）每基因型。你至少需要与植物一样多的微量离心管，加上一些备件（10-20％）以允许苗的生长失败。
使用剪刀或热刀手术刀，切下帽和底部，每个微量离心管5 mm（或以上）。
切一块高约2厘米的岩棉，用自来水浸透，放入合适的塑料盘。
使用软木钻孔器，非常轻轻地打出一个湿的岩棉缸。这需要一些实践。用非常小的力向下推，同时向左和向右旋转打孔机以帮助它向下工作。通常气缸将被困在钻孔器中;使用合适的工具轻轻地将其从钻孔器的顶部推出。重要的是，圆筒不被压碎，使得苗的根部可以容易地穿透基体（参见图2A，B）。

图2。设置岩棉塞。A.轻轻地旋转，用8毫米软木钻头从饱和岩棉切割一系列圆柱体。当您到达底部时，用力推动气缸自由切割。 B.使用塑料工具轻轻地将圆筒从钻孔器中推出。 C.将每个圆筒放在黑色的微量离心管中，使岩棉与管的顶部齐平。 D.将管放入架。你可以在这个阶段填充每个洞。
制作与步骤2中准备的微量离心管数量一样多的岩棉滚筒。
使用镊子，将气瓶放在每个管中，轻轻压入到位，使气瓶与管的顶部齐平。再次，不要压缩岩棉（见图2C。无论岩棉如何粘在管子顶部边缘上方几毫米，而是越靠近管子底部，越少的解决方案你需要保持湿）。
稀释0.5x Hoagland的营养液1（2）（ 0.25x），放在生长箱底部足够到达架子底部，并用管子填满架子的孔含石岩棉。在早期生长建立期间，机架中的所有位置可以填充有管。稍后，当植物成熟时，管将需要在多个架之间分开（参见步骤13）。在这一点上，管和岩棉可以被高压灭菌，但这是可选的
润湿一些细镊子的尖端，然后拾取约5-10个拟南芥种子。将种子存放在岩棉表面，并对所有管重复。
关闭盒子上的盖子，并在4℃下将种子分层三天
将盒子转移到一个大约的成长室。 100-200μmol光子m-2秒-1光强度，21℃，长天（16小时光），用于快速生长。保持盖子关闭。
大约三天后，在接下来的三天左右逐渐提起盖子。我们使用1毫升移液器提示在第一天支撑盖子打开约1厘米，逐渐向后移动，以进一步打开盖子。这有助于保护幼苗免受干燥气氛的冲击。检查营养液是否仍然与管的底部接触;如果他们干了，幼苗会死的很快！如有必要，加上0.25x Hoagland的解决方案。
当幼苗是七天大时，完全打开盖子，使用细镊子将幼苗稀释至每管1个。此时，用0.5x Hoagland's替换营养液，并通过补充所需体积的GR24（5μM终浓度）或丙酮用于未处理的对照开始GR24处理。建议您在瓶中的溶液中加入激素/丙酮，充分混合，然后将所需体积分配到盒子中。
约10-12天后，根应该从管的底部出来并漂浮在培养基中。在这一点上，在根变得太长之前，将幼苗分成与实验所需的盒子一样多，考虑到每株植物需要多少空间。处理任何多余的植物（但保留试管用于任何未来的实验）
允许植物生长，保持眼睛的营养水平。在观察植物的时间，消耗的GR24激素和营养物交换频率之间存在权衡。我建议在前两个星期的生长，每5天左右改变解决方案。三个星期后，植物消耗更多的营养，所以解决方案将需要交换每3到4天，这取决于湿度。 GR24的稳定性是另一个问题;它容易水解，并且非常接近（和宽泛）的猜测将是它在这些条件下具有1周的半衰期。不要"加满"解决方案;请根据需要用新鲜溶液和GR24充分更换
当植物开始花时，不再需要继续GR24处理，因为所有的莲座叶都将形成。在这一点上，计算玫瑰花叶的数量，你应该表示每个玫瑰叶的分支数量。
当主花序停止产生花时，是时候计数腋枝的数目，如果需要，计数主花序茎的高度。如果生长超过5毫米，我们通常计算腋窝分支

预期结果

对于内源性独脚金内酯的合成或水平缺乏的突变体，相对于未处理的对照，腋窝分枝的数目应当减少。对于独脚金内酯不敏感突变体，分枝数目不应受到显着影响。野生型植物通常不显示分支数目的显着减少，因为它通常是低的（1-2个分支，取决于生态型和生长条件）。在我们的手中，这种方法不导致完全拯救独脚金内皮缺陷型突变表型到野生型水平，但明显减少分支。

食谱

0.5×Hoagland营养液（pH5.9）
从Heeg等人修改。（2008）
Hoagland的解决方案
使用MilliQ水制备，在室温下储存溶液I和II，在4℃下储存所有其它溶液使用在121℃下15分钟的循环，高压灭菌所有溶液（EXCEPT Solution I）。
储备溶液I（500×）：1μMCa（NO 3）2+ 236.4g/l 236.2g/L，过滤灭菌
储备溶液II（500x）：1M KNO 3 101.1g/L，高压釜
储备溶液III（1,000x）：0.5M NH 4 NO 3 40.0g/L，高压釜
储备溶液IV（500×）：0.25M MgSO 4。 7H 2 O 61.6g/L，高压釜
储备溶液V（1,000x）：0.25M KH 2 PO 4 4 34.0g/L，高压釜
储备溶液VI（5,000x）：0.25M KCl 18.6g/L，高压釜
微元素储备溶液（2,000x）：
0.05 M H sub 3 BO 3 1.546 g
0.004M MnCl 2 4 H 2 O 0.396g
0.004M ZnSO 4 sub
H H 2 O 0.575g
0.001 M CuSO 4 5 H sub 2 O 0.125 g
0.0003 M CoCl 2 ^。 6 H 2 O 0.036 g
0.00015 M（NH 4）6 Mo 7+ O 24。 H sub> 2 O 0.093 g
加入500ml ddH 2 O，高压釜 10mM Fe-EDTA储备溶液。（250×）：367.1mg/100ml，高压灭菌如果不溶解，检查pH值，用5N KOH或1N NaOH调节pH值到8.0（如果你想在溶液中加入一些钠离子）。
对于10 L Hoagland的解决方案：
将5g MES溶解在8L milliQ水中，并在混合下加入：
储备溶液I 20 ml
储备溶液II 20 ml
储备溶液III 10 ml
储备溶液IV 20 ml
储备溶液V 10 ml
储备溶液VI 2 ml
微量元素5 ml
Fe-EDTA 40ml
用5N KOH将溶液的pH调节至pH 5.8-6.0。这是关键：GR24在低或高pH时越来越不稳定。补偿音量高达10 L.

致谢

我们感谢Brent Kaiser博士（澳大利亚阿德莱德大学）为我们提供了本协议中概述的水培方法。该方案进一步从Hoagland和Arnon（1941）开发。用于生长没有土壤的植物的水培养方法来自杂项出版物，包括Gibeaut等人（1997）和Tocquin等人（2003）。该工作由澳大利亚研究委员会（LP0776252（RJ）和DP1096717（MW））的赠款资助。

参考文献

Gibeaut，D.M.，Hulett，J.，Cramer，G.R.and Seemann，J.R。（1997）。拟南芥的最大生物量使用简单，低维护的水培法和有利的环境条件。植物生理学 115（2）：317-319。
Heeg，C.，Kruse，C.，Jost，R.，Gutensohn，M.，Ruppert，T.，Wirtz，M。和Hell，R。（2008）。拟南芥O-乙酰丝氨酸（硫醇）裂解酶基因家族的分析证明半胱氨酸合成调节的区室特异性差异。植物细胞 20（1）：168-185。
Hoagland，DRand Arnon，DI（1941）：用于生长植物的水培养方法杂项出版物 354：347-461。
Waters，M.T.，Nelson，D.C.，Scaffidi，A.，Flematti，G.R.，Sun，Y.K.，Dixon，K.W.and Smith，S.M。 DWARF14蛋白家族中的专业化对拟南芥中的karrikins和独脚金内酯具有不同的反应。开发 139（7）：1285-1295。
Tocquin，P.，Corbesier，L.，Havelange，A.，Pieltain，A.，Kurtem，E.，Bernier，G。和Perilleux，C。拟南芥同步生长和开花的新型高效，低维护，水培系统。 BMC Plant Biol 3：2.