材料和试剂

60毫米TC处理的中心器官培养皿（Corning，Falcon ，产品目录号：353037）
培养皿（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：130182）
试管（15和50毫升）（Denville Scientific，产品编号分别为C1012和C1062-P）
不锈钢网格（0.5毫米孔径）（Home Depot International，型号：3004107，目录号：1001034564）
Millipore型过滤器（0.8μm孔径，47 mm直径）（Merck，目录号：AAWP04700）
无菌独立包装的移液管（2,5和10ml）（Genesee Scientific，目录号：12-101,12-102,12-104C）
E10.5-E11.5小鼠胚胎
70％乙醇
95％乙醇
6-氨基烟酰胺（Alfa Aesar，目录号：L06692）
2mm直径的琼脂糖珠或Affi-Gel蓝色凝胶（Bio-Rad Laboratories，目录号：732-6712）
内皮素1肽（Enzo Life Sciences，目录号：ALX-155-001-PC01）
百里酚（Sigma-Aldrich，目录号：T0501）
磷酸氢二钠七水合物（Na 2 HPO 4•7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：S9390）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
氯化钾（KCl）（Fisher Scientific，目录号：BP366）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Fisher Scientific，目录号：P286-1）
含有L-谷氨酰胺的BGJb培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：12591038）
胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F0926）
抗坏血酸（Fisher Scientific，目录号：S25184）
青霉素 - 链霉素100x（Caisson Laboratories，目录号：PSL01-100ML）
MEM非必需氨基酸溶液100x（Sigma-Aldrich，目录号：M7145）
冰醋酸（Fisher Scientific，目录号：S25118A）
氢氧化钾（KOH）（Sigma-Aldrich，目录号：P1767）
Alcian Blue 8GX（National Diagnostics，产品目录号：HS-504）
茜素红S（Acros Organics，目录号：400480250）
甘油（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：17904）
核固红（Acros Organics，目录号：211980050）
10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
下颌外植体媒介（见食谱）
3％醋酸溶液（见食谱）
2％的KOH溶液（见食谱）
阿尔新蓝溶液pH 2.5（见食谱）
茜素红溶液（见食谱）
1％KOH / 20％甘油溶液（见食谱）

设备

手术剪（世界精密仪器公司，目录号：501225）
无菌细胞培养罩（NuAire，型号：NU-545）
立体显微镜（尼康公司，型号：SMZ800N）
镊子（世界精密仪器，目录号码：15915）
自动流动IR直接加热CO 2培养箱（NuAire，型号：NU-5510）
陶瓷热板（VWR，目录号：97042-602）
移液泵（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：9511）
高压灭菌器（Future Health Concepts，Primus，目录号：PRPSS8-A）

软件

用于立体显微镜的NIS Elements AR软件（Nikon Instruments）

程序

胚胎（E10.5-E11.5）提取
1. 通过CO 2 2执行安乐死，然后在怀孕的雌性小鼠上颈椎脱臼（参见注释1）。所有的动物程序均由休斯顿得克萨斯大学健康科学中心的动物福利委员会（AWC-16-0068）批准，并遵循Metwalli等人所述的国家卫生研究院指导方针，
2. 将动物转移到干净的手术室。
3. 在女性的腹部喷洒乙醇（70％）。
4. 用剪刀将腹部皮肤从下腹部切到上腹部。
  在腹部中线进行切割
5. 将子宫拉出体外，切开结缔组织。这将分离子宫从输卵管和卵巢。
6. 将所有的胚胎放在子宫袋里。
7. 将麻袋放入培养皿中，用冷的1x PBS（15-20毫升，见方法1）。
8. 在无菌罩中，通过切割胚胎之间的子宫分开胚胎。
9. 将所有胚胎转移到一个新的培养皿中，用1x PBS（15-20 ml）在室温下清洗并去除多余的血液。
10. 打开羊膜囊，将胎盘与胚胎分离，切断胚胎附近的脐带。
11. 将胚胎放入15毫升的试管中。
12. 每个胚胎用5毫升的1x PBS洗两次（见注2）。
下颌提取
1. 在无菌细胞培养罩中，在RT下在BGJb培养基中，在立体显微镜下解剖第一咽弓的下颌骨过程。
2. 预温BGJb培养基和下颌外植体培养基（见方案2）在37℃。在室温下将1-2ml的PBS加到中心器官培养皿的外部，并将0.5ml的下颌外植体培养基加到器官培养皿的中心孔。
3. 将胚胎定位于仰卧位。使用手术刀，切口的每个角嘴唇连合处，以便从胚胎的头部分离下颌骨的过程（见图1）。
  
  图1. E11.5中的小鼠胚胎用于解剖用于体外实验的下颌骨过程。（A）第一次切口是在口腔一直到后脑（A）处进行的。第二次切割是在脖子顶部进行的，以便将下颚过程与身体的其余部分分开（B）。
4. 用手术刀再次切割每个胚胎的颈部，将下颌骨与胚胎的其余部分完全分开。
5. 将一个不锈钢网放置在中心器官培养皿中，以便将其浸入下颌外植体培养基中（见图2，参见注释3）。
  
  图2.器官培养皿上下颌外植体的设计
6. 将滤纸铺在金属网片的上面，让滤纸浸没在下颌外植体中（见注4）。
7. 将外植体放在滤纸的中央。
8. 将培养皿置于37℃的CO 2培养箱中。
9. 每24小时，每12小时更换一次培养基（0.5毫升），预热（37℃）新鲜下颌外植体培养基，最初24小时后每天一次。
10. 温育12小时后，在下颌骨外植体培养基中用100mg / ml的6-氨基烟酰胺处理下颌骨切片3小时。在我们的研究中，6-氨基烟酰胺处理被用于实验样品中作为外植体的致畸剂（参见注释5）以扰乱适当的组织发育。
11. 治疗3小时后，用新鲜的预热（37℃）下颌外植体培养基替换含有致畸原的培养基。
12. 在我们的例子中，在畸胎治疗后，将实验性下颌骨样品在CO 2培养箱中用含0.1μg/ ml内皮素-1（Edn1）肽的2mm直径琼脂糖珠处理8小时在37°C（见注6）。应用Edn1检测Meckel的软骨和周围组织是否对这种信号分子有反应，是否能拯救基因突变的表型。
13. 8小时处理后，取出含有Edn1肽的培养基和琼脂糖珠。
14. 用预热的（37℃）新鲜下颌外植体培养基更换中心孔中的培养基（0.5ml）。在第一个24小时后，每天更换一次媒体（见注7）。＆nbsp;
15. 24-120小时后，在室温下用95％乙醇固定外植物1-2天。
16. 用2％KOH代替95％乙醇（见方法4）2-4小时，直到外植体组织变得透明。
17. 在RT下用Alcian Blue染色代替2％KOH过夜（参见配方5）。阿尔新蓝染色软骨中发现酸性糖胺聚糖。
18. 用95％乙醇替换染色12-24小时
19. 在室温下用茜素红染色（参见配方6）替换95％乙醇6小时（图3）。茜素红染色含钙骨细胞。
20. 将外植体浸没在20％甘油和1％KOH中（参见配方7）以除去多余的染色。
21. 用100％甘油代替溶液，在4°C储存。
  可以在储存溶液（可选）中加入抗真菌剂如百里酚
  
  在E11.5处，离体下颌外植体模型A.在E11.5处提取胚胎下颌骨外植体并培养两天。图像是从侧面看。 B.培养2天后，阿辛蓝染色的下颌骨外植体用于Meckel's软骨。图像从下颌骨的顶视图被采取了。 C.培养4天后下颌外植体的阿尔新蓝和茜素红染色。

数据分析

在外植体上进行骨骼染色并使用软件NIS Elements AR通过立体显微镜观察。对于我们的研究，我们检查了软骨和骨形成的变化。在这种情况下，我们观察到的变化包括缺乏对称性，软骨的生长停滞，以及麦克尔软骨的形状和厚度。建议使用至少五个技术重复，即来自同一垃圾的五个胚胎，为每个实验处理，以解释任何内在的变化。

笔记

想要提取的胚胎的年龄可以通过与男性一起繁殖的日期以及怀孕女性中存在的交尾塞来确定。
每个胚胎应至少洗两次。如果血液仍然存在，胚胎应该被清洗直到所有的血液被移除。在所有操作步骤中胚胎必须保持湿润。
将钢网用铡刀切成1厘米×1厘米的三角形，以置于器官培养皿的内部培养基的顶部。在我们的案例中，钢丝网是通过将其浸入乙醇中并将其放在火上进行消毒的。
将Millipore滤纸切成1cm的正方形，以适应器官培养皿的内部孔。
在用Edn1配体处理之前，将6-氨基烟酰胺直接加入到培养基中。包括没有预先处理6-氨基烟酰胺且仅用Edn1处理的外植体作为对照。
Edn1通过在2mm琼脂糖珠上直接移液并孵育5分钟来递送。将包含Edn1的珠子用钳子置于下颌外植体的任一侧，并放置8小时以使分子扩散出来。
下颌骨外植体可以保持培养长达一周，没有任何明显的坏死或恶化。
本协议中使用的所有工具和解决方案应该是无菌的。

食谱

10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）
25.6克Na 2 HPO 4•7H 2 O
80克NaCl
2克KCl
2克KH 2 PO 4 4克/克加蒸馏水至1L，用陶瓷板和磁力搅拌棒溶解盐。
对于1x PBS，将900ml蒸馏过的H 2 O中的100ml 10x PBS稀释。通过高压灭菌来消毒
下颌外植体媒体
47.5ml补充有L-谷氨酰胺的BGJb培养基 3％FBS（1.5ml / 50ml培养基）
7毫克的抗坏血酸
0.5 ml链霉素 - 青霉素溶液（100x）
MEM 0.5ml MEM非必需氨基酸溶液（100x）
3％醋酸溶液
3毫升冰醋酸
97毫升蒸馏水
2％氢氧化钾（KOH）溶液
2克氢氧化钾
100毫升蒸馏水

使用陶瓷板和磁力搅拌棒充分混合
阿尔新蓝溶液（pH 2.5）
1克Alcian蓝，8GX
100毫升3％醋酸溶液
用陶瓷板和磁力搅拌棒充分混合。使用醋酸将pH值调整到2.5。
茜素红溶液
0.5毫克茜素红S
100毫升1％氢氧化钾
用陶瓷板和磁力搅拌棒充分混合。最终浓度为1％氢氧化钾中0.005％（w / v）茜素红
1％KOH / 20％甘油溶液
20毫升甘油
50毫升KOH（2％）
30毫升蒸馏水

使用陶瓷板和磁力搅拌棒充分混合

致谢

我们要感谢Ali Naji和Katherine Kin博士对于离体下颌外植体检测的出色帮助。创造说明性图2的维多利亚谢的贡献非常感谢。本研究得到了得克萨斯州骨病研究计划的支持，并得到了得克萨斯大学健康科学中心休斯敦分校牙医学院的Walid Fakhouri博士的支持。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

Chai，Y.，Mah，A.，Crohin，C.，Groff，S.，Bringas，P.，Jr.，Le，T.，Santos，V.和Slavkin，H.C。（1994）。具体的转化生长因子β亚型调节胚胎小鼠美克尔的软骨和牙齿发育 Dev Biol 162（1）：85-103。
Fakhouri，W. D.，Metwalli，K.，Naji，A.，Bakhiet，S.，Quispe-Salcedo，A.，Nitschke，L.，Kousa，Y.A。和Schutte，B.C。（2017）。 Irf6与Twist1在颅面发育过程中的细胞间遗传相互作用 / em> 7（1）：7129。
Jin，Y.R.，Turcotte，T.J.，Crocker，A.L.，Han，X.H。和Yoon，J.K。（2011）。经典的Wnt信号激活剂R-spondin2通过外胚层调节鳃弓内的颅面模式和形态发生-mesenchymal interaction。开发生物学 352（1）：1-13。
Metwalli，K.A.，Do，M.A.，Nguyen，K.，Mallick，S.，Kin，K.，Farokhnia，N.，Jun，G。和Fakhouri，W.D。（2017）。干扰素调节因子6是唾液腺和胰腺发育所必需的。 J Dent Res 1-11。
Miettinen，P.J.，Chin，J.R.，Shum，L.，Slavkin，H.C.，Shuler，C.F.，Derynck，R。和Werb，Z。（1999）。表皮生长因子受体功能是正常颅面发育和腭闭合所必需的。 > Nature Genetics 22（1）：69-73。