材料和试剂

移液器提示
组织培养物处理的培养皿（CELLSTAR 100×20mm，Greiner Bio One International，目录号：664160; 6孔，Greiner Bio One International，目录号：657160; 96孔，Greiner Bio One国际，目录号：655160）
Falcon 15-ml锥形离心管（Corning，Falcon ，目录号：352196）
Falcon 50-ml圆锥形离心管（Corning，Falcon ，目录号：352070）
微量离心管，1.5毫升（SARSTEDT，目录号：72.690.001）
Minisart 0.45μm一次性过滤器（Sartorius，产品目录号：16537-K）
60毫升注射器（BD，目录号：300866）
96孔E板（E-plate 96）（ACEA Bio，目录号：5232368001）
感兴趣的细胞系，例如HEK293细胞（ATCC，目录号：CRL-1573）
磷酸盐缓冲液（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：D1408）
例如ECM分子，纤连蛋白（牛血浆）（Sigma-Aldrich，目录号：341631）;胶原蛋白（来自小牛皮肤的胶原）（Sigma-Aldrich，目录号：C8919）
HyClone TM HyQTase细胞分离试剂（GE Healthcare，HyClone TM，目录号：SV30030.01）
Dulbecco改良的含高葡萄糖（4500mg / L）的Eagle培养基（DMEM）（Sigma-Aldrich，目录号：D5671）
L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25030149）
胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F7524）
用于细胞培养的胰蛋白酶-EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：T4049）
≥96％纯牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A8022）
用于培养感兴趣的细胞系的适当生长培养基（见食谱）
在实验中使用适当的基础培养基（见食谱）
纤连蛋白 - 胶原蛋白混合物（见食谱）
0.1％BSA（见食谱）

设备

可调容量移液器（例如，Fisher Scientific，型号：Fisherbrand TM Elite TM）
水浴
多通道移液器（例如，Fisher Scientific，Fisher ScientificTM，FisherbrandTM TM Elite TM）
37℃，5％CO 2水夹套培养箱（例如，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：8000系列水夹套CO 2培养箱）
细胞培养层罩（例如，NuAire CellGard TM）
用于15ml和50ml锥形管（例如Eppendorf，型号：5804）的台式离心机。
Bürker细胞计数室（，例如，BRAND，目录号：719520）
明场显微镜（例如，奥林巴斯，型号：CKX41或ZEISS Axio Vert）
xCELLigence RTCA SP仪器（ACEA Bio，完整系统的产品目录号：00380601030）包括：
1. RTCA分析仪（ACEA Bio，型号W830，产品目录号：05228972001） - 一种电子分析仪，用于测量，处理和分析传感器电极检测到的阻抗。
2. RTCA SP Station（ACEA Bio，产品目录号：05229057001） - 置于培养箱内的E板支架，将E板连接至RTCA分析仪。
3. RTCA控制单元（ACEA Bio，目录号：05454417001） - 带预装RTCA软件的笔记本电脑

软件

RTCA软件（版本号1.2.1.1002）
Microsoft Excel
GraphPad Prism 6（版本6.05）

程序

注意：

在无菌条件下执行所有步骤。
避免触摸检测器所在平板的下侧。
避免划伤位于井底的电极。这可以通过移液管吸头与电极接触而发生。去除溶液时，稍微倾斜平板，将吸管放在孔的一侧，轻轻吸取溶液。
使用至少3-4个井作为技术上的重复测试每个条件
在计数/接种之前，通过充分混合细胞悬液并确保足够的细胞 - 细胞解离，避免E-plate 96孔中细胞计数和/或细胞结块的错误。在适当的情况下使用多道移液器，以确保每个孔都添加细胞。
优化每个待测细胞系的细胞数量;为了监测细胞与ECM的粘附，最好避免细胞/汇合单层过度拥挤。
E-plate 96每孔的最大推荐体积为200μl。
有关更多信息，请参阅故障排除指南（请参阅Notes部分中的表1）。

准备电子盘
1. 用150μl无菌PBS冲洗孔，然后吸出缓冲液。
2. 用100μlECM分子或100μl0.1％BSA（阴性对照，参见食谱）在37℃下包被1小时。
  注：ECM涂层的选择取决于所使用的电池。对于细胞粘附力弱的HEK293细胞，我们过去使用纤连蛋白和胶原ECM分子的混合物（参见食谱）。
3. 去除涂层，用150μlPBS洗两次。
4. 通过将所有孔与100μl0.1％BSA在37℃下孵育1小时，阻断非特异性细胞与E板的结合。
5. 去除BSA，用150μlPBS洗两次。
6. 在每个孔中加入50μl预热的基础培养基（参见配方），并在开始实验之前将E-plate留在培养箱（37℃）中至少15分钟，以确保培养基和E-板面达到平衡。
设置xCELLigence RTCA程序
注意：程序设置需要在开始实验之前完成。
1. 启动RTCA程序。
2. 设置实验注释页面（图2A） - 选择要保存实验文件的文件目录，填入实验信息，如实验日期，细胞系和处理，实验程序，一个目的和任何额外的信息，你想保存。
3. 设置 Layout 页面（图2B）。该页面记录运行的实验布局。请注意，未标记的井将不会被扫描。一次选择一个或多个孔（复制）（选定的孔将被高亮显示）。输入每个孔的适当信息，例如细胞类型，细胞数量，使用的化合物等。例如：Cell Type-HEK293，control，Cell number-20,000。
  
  图2.设置xCELLigence RTCA程序 - 实验细节 “注”（A）和 Layout 显示了用HEK293细胞进行的实验。每个条件包括四个技术重复。选定的蓝色井的详细信息可以在页面顶部看到。
4. 为平板运行程序设置 Schedule 页面（图3）。实验可以分为多个步骤，其中包含一个或多个扫描。一次扫描包括对所有选择的孔进行一次扫描（每个孔一次）。
  1. 步骤1被认为是背景（基线）测量，即在添加细胞（孔仅含有基础培养基）之前对E板进行扫描。第一步预编程为一次扫描。不要更改第1步的设置。
  2. 每次使用添加步骤选项（图3）从RTCA仪器中移除E盘时，请单独制作一个 Step >步骤2 添加细胞，步骤3 添加化合物）。
  3. 如果要以不同的速率测量事件，请使用添加子步骤并编辑间隔来连续扫描， / em>和扫描，方法是输入适当的值并单击应用。在下面的例程中，程序会在 Step 1 后暂停，但是会自动从步骤2.1 （子步骤）移动到步骤2.2 <子步骤需要手动确认。扫描之间的间隔越短，对于检测快速和潜在的短期事件，例如初始细胞附着到基质，都是有用的。
    为HEK293细胞设立的一个例子：
    1. 第1步（背景测量）; 1扫（总时间00:00:06）。
    2. （，例如，子步骤监视初始单元格连接到底层）。 16次扫描，间隔2分钟（总时间为00:30:06）。
    3. （例如，子步骤用于监测随后的细胞铺展和对基质的粘附）。 18次扫描，间隔5分钟（总时间02:00:06）。
    为MEF设立的一个例子：
    1. 第1步（背景测量）; 1扫（总时间00:00:06）。
    2. 第二步（监视细胞附着和扩散）; 18次扫描，间隔10分钟（总时间03:00:06）。
    注意：优化感兴趣细胞系的扫描次数和间隔时间非常重要。为了避免浪费E板，首先使用正常的96孔板来发现细胞粘附的时间线，即当一些细胞粘附非常快（几分钟）并在2小时内扩散时，其他细胞可能需要更长的时间来粘附传播（3-4小时）。当首次进行xCELLigence粘附实验时，可以使用较短的时间间隔（如上述步骤2.1）1小时监测细胞指数，然后相应调整下一个实验的参数。
    
    图3.设置xCELLigence RTCA程序时间表 - 步骤和扫描。 HEK293单元显示了 Schedule 页面的示例。步骤1（A）是预编程的，不应该改变。使用添加步骤和/或添加子步骤（A）在计划（B）中插入具有不同扫描和间隔的其他实验步骤。
使用xCELLigence RTCA背景阅读执行细胞粘附实验
1. 一旦程序设置完毕（见上文），将预先准备好的预热的含有50μl基础培养基的E-plate放入RTCA SP站。
2. 点击开始开始实验。这将启动 Step 1 来测量基本介质的背景阻抗。这个读数被用作细胞指数值的参考阻抗。
3. 现在， Step-Status 会显示 TEST 。检查消息页面，了解被测井的状态和连接是否正常。
  重要提示：排除任何会导致读数异常的井。基线读数预计接近于零。请参阅故障排除部分（表1）。
4. 完成 Step 1 后， Step-Status 显示 DONE ，程序已准备好进行下一步。
  注意：RTCA程序不会进入下一步，直到手动指示为止。
5. 从RTCA SP Station上取下E盘，然后继续添加单元格。
使用xCELLigence RTCA加入细胞进行细胞粘附实验
1. 去除HEK293细胞的生长培养基（见食谱）。用5毫升的无菌PBS洗细胞。
2. 去除PBS，加入2毫升预热的HyQtase（体积调整为汇合的10厘米培养皿），并在37°C孵育板，直到所有的细胞已经分离。
3. 加入5ml的基础培养基，然后通过离心（180×g，4分钟）收集细胞。
  注意：如果使用胰蛋白酶分离细胞，建议使用胰蛋白酶抑制剂或加入含有血清的5ml生长培养基来抑制胰蛋白酶活性。我们推荐使用HyQtase或其他类似的产品，而不是像胰蛋白酶这样的消化酶来分离整合素功能正在研究的短期测定的细胞。整合素对胰蛋白酶切割敏感，因此使用胰蛋白酶可影响细胞粘附到涂覆的E板上所需的时间。在一些情况下，当细胞非常粘附时，使用胰蛋白酶可能是不可避免的，并且ECM降解需要破坏细胞-ECM连接。
4. 弃去上清液并将剩余的细胞沉淀重新悬浮在4ml的基础培养基中。
  重要提示：多次上下轻轻打结，打破细胞团块。
  注意：如果使用生长培养基抑制胰蛋白酶，离心后确保完全除去培养基，用无血清基础培养基重新洗涤沉淀，重复上述离心步骤。
5. 使用所选择的方法（例如，Bürker细胞计数室）对细胞进行计数，制备2×10 5个细胞/ ml（在基础培养基中稀释）的细胞悬液并转移100μl（20,000个细胞;针对HEK293细胞系进行了优化）到预先制备的E-plate的每个孔（已经含有50μl的基础培养基;因此每个孔的总体积现在为150μl）。
  注意：细胞数量必须针对每个感兴趣的细胞系进行优化，以便细胞有足够的空间来粘附和扩散。建议使用正常组织培养处理的96孔板和明场显微镜进行这种优化，因为E-plate 96更昂贵。我们过去在xCELLigence细胞粘附测定中使用了以下细胞和细胞数目：MEF和人端粒酶永生化成纤维细胞：7,500-10,000; MDA-MB-231细胞：15,000-20,000;人类iPSC：50,000。但是，这些只是指导原则。不同的实验处理或培养条件可能影响细胞存活或细胞大小，因此最好相应地优化细胞数量。
  重要提示：执行大量条件时，单元格添加到井的顺序可能会影响数据。例如，如果对照细胞粘附非常快，并且您预期处理的细胞将响应更慢，则如果始终将对照细胞加入孔中并且经过几分钟，然后可以对处理的细胞进行铺板，则这种差异可能被夸大。为了克服这个潜在的问题，尽可能地尝试使用多道移液器以加速细胞添加，并尝试改变细胞添加到生物重复中的孔的顺序，以查看数据是否受到细胞添加顺序的影响。如果这似乎是这种情况，考虑减少实验的复杂性，以减少细胞之间的电镀间隔。
6. 将E-plate重新插入RTCA SP Station，然后点击 Start 以扫描 Step 2 。
  重要提示：分析数据时，步骤2的第一次测量应被视为时间点0。
7. 在实验过程中，您可以按照 Plot 页面实时查看细胞索引。为此，请选择感兴趣的孔/孔，然后单击添加。通过单击添加所有实验中包含的每个孔都被绘制出来。
8. 完成实验后，打开 Plot 页面，点击全部添加，然后选择一个全时标度，如果您希望收集整个实验的数据。如果点击平均值，复制孔（名称相同的孔）将被合并，只导出平均单元格索引值。通过选择 Plate-Export Experiment Info ，将原始数据（单元格索引与时间）导出到Excel电子表格中。

数据分析

对于实验设计，为了比较两个数据集，我们进行至少三次独立时间的xCELLigence粘附分析。对于每个实验，我们至少使用三个技术重复。
细胞粘附作为实时平均细胞指数值的变化呈现（见图4的图解说明）。我们通常观察到技术重复的范围为0.001-0.15的标准偏差（SD），以及n = 4生物重复的0.02-0.2的标准偏差（最高的SD出现在较晚的时间点）。我们使用GraphPad Prism和Student's t -test在两个数据集的终点单元格索引值之间执行统计分析。

图4.来自两个数据集的xCELLigence细胞粘附结果的分析 xCELLigence RTCA数据的实例分析显示细胞粘附作为平均细胞指数±SEM与时间的关系。这里，时间点0表示电池添加之后E板96首先被扫描的点。 E-plate 96的初始扫描（ Step 1 ）用于在没有细胞的情况下监测背景读数，不包含在分析中。对两个数据集之间的终点单元索引值进行统计分析（用浅紫色框突出显示）。

笔记

细胞粘附测定相对简单且可重现。然而，与该测定相关的一个常见问题是，细胞可能在播种后积累在井的中间而不是整个井中。这将导致不准确的细胞指数值和实验之间的变化增加。在xCELLigence手册中，建议在细胞接种后将平板保持在室温30分钟以使细胞沉降到平板的底部;然而，这不是细胞粘附测定的选择，因为细胞会立即开始粘附，因此这些早期粘附事件的记录将会丢失。因此，电镀完成后尽快将印版送回RTCA SP工作台E板固定器是非常重要的，并立即开始 Step 2 。正如我们的协议中所述，我们建议预加热E板，在电镀之前和电镀之后，如果可能的话使用多通道移液器进行中等和彻底的细胞混合。此外，一旦细胞已经播种，我们已经发现，在顺时针方向顺时针方向上平板上的轻微搅动有助于使细胞更均匀地分散在整个孔中。尽管如此，如果第一次进行测定，或者如果使用新细胞系，特别是上皮细胞或内皮细胞，我们推荐使用正常组织培养处理的96孔板来优化细胞数字和细胞添加技术。
这里使用的电子版不适合亮视野成像。尽管可以购买专门的电子版用于获得相位差图像，但是这些成本更高。此外，除了预先设定的步骤（例如药物添加）之外，不建议停止RTCA程序或长时间移除E板。如果需要对细胞进行目视检查，我们推荐使用正常组织培养处理的96孔板，以完全相同的方式（即，相同的涂层，阻塞和细胞数量）设置，并与xCELLigence粘附分析平行进行。
疑难解答指南（表1）

表1. xCELLigence细胞粘附分析的故障排除指南。该表格包含用户在分析过程中可能遇到的一些常见问题的建议。但是，这张表并不是详尽的，如果需要的话，用户应该参考制造商的手册以获得进一步的建议。

食谱

HEK293生长培养基
445毫升无菌达尔伯克氏改良伊格尔培养基（DMEM）与高葡萄糖
5毫升无菌200毫米L-谷氨酰胺
50毫升无菌胎牛血清（FBS）
在4°C储存长达1个月
HEK293基础培养基（无血清生长培养基）
495毫升无菌DMEM
5毫升无菌200毫米L-谷氨酰胺
在4°C储存长达1个月
ECM分子的选择
纤连蛋白 - 胶原蛋白混合物：

用无菌PBS稀释无菌原液制备10μg/ ml纤连蛋白和20μg/ ml胶原的混合物重要：不要过滤工作溶液，因为这会导致过滤器上ECM分子的损失。只使用新制备的工作解决方案。
注意：对于具有不同粘附特性的其他细胞系，如果使用其他ECM蛋白，建议首先测试您的特定实验的最佳ECM配体浓度（图1）。
0.1％BSA
在100ml无菌PBS中稀释0.1g的96％BSA并过滤灭菌只使用新鲜准备的工作解决方案

致谢

这项工作得到了芬兰科学院，ERC合并补助金（615258），Sigrid Juselius基金会和芬兰癌症组织的资助。 J.L.由图尔库分子医学博士课程（TuDMM）提供支持。该协议是根据Georgiadou等人（2017），Lilja等人（2017），Närvä等人发表的程序改编的。（2017）。作者宣称没有利益冲突。

参考

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