材料和试剂

滤纸（Sangon Biotech，目录号：F503311）
细土
纱布和橡皮筋
无RNA酶管（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM12400）
无RNA酶的吸头（Sangon Biotech，目录号：F611216）
刷子
洗瓶（Sangon Biotech，产品目录号：F505001-001）
Pooter
黑布
牙签
新鲜的叶子（从30天的大米收集）
RNA提取试剂
1. Trizol试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15596018）
2. 氯仿（上海凌峰化学试剂有限公司CAS：67-66-3）
3. 75％乙醇（Singpharm Chemical Chemical Reagent，目录号：10009257）
4. 无RNase双蒸H 2 O
注意：所有储存在4°C。
逆转录试剂盒（Vazyme Biotech，目录号：R223-01，保存于-20°C）
灭菌珠（Sangon Biotech，目录号：B529319-0025）
TAE缓冲液（Sangon Biotech，目录号：B548101-0500）
琼脂糖（YEASEN，目录号：10208ES60）
DNA生产商2,000 bp（Takara Bio，目录号：3427A）
溴化乙锭（Sangon Biotech，目录号：A600195）
反P10
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白G（YEASEN，目录号：33201ES60）
TMB彩色底物溶液（Sangon Biotech，目录号：C510025-005）
碳酸钠（Na 2 CO 3）
碳酸氢钠（NaHCO 3）
氯化钠（NaCl）
氯化钾（KCl）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）
磷酸氢二钠十二水合物（Na 2 HPO 4•12H 2 O）
5％脱脂奶粉（Sangon Biotech，目录编号：A600669）
4-氯-1-萘酚
30％H 2 O 2
肥料溶液（含5％尿素）
碳酸盐涂层溶液（见食谱）
10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
PBS-T（见食谱）
阻止解决方案（见食谱）
TMB彩色基板解决方案（见食谱）

设备

1升烧杯（Sangon Biotech，产品目录号：F606544-0001）
PCR仪（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，型号：Veriti TM 96-Well热循环仪）
移液器
带蓝色瓶盖的玻璃瓶（Sangon Biotech，目录号：F505041）
微波炉（Sangon Biotech，目录号：G003408-0001）

软件

凝胶成像软件

程序

准备饲养昆虫的幼苗
1. 在接种RBSDV之前，需要80-100个水稻幼苗以获得大量的小褐飞虱。水稻品种“武育粳3号”的丰满种子通过将其浸入水中预发芽2天，用水彻底冲洗，然后使其在水浸滤纸上发芽1天。
2. 加入150-200毫升细土，清洗1升烧杯，沿烧杯壁加100毫升水。
3. 然后将约100个预发芽的种子散布在土壤上，撒上一层薄薄的土壤。用纱布覆盖烧杯（图1），置于25-27℃，相对湿度50％-70％，14/24小时光照强度为5,000-7,000勒克斯的生长室的架子上，直到水稻幼苗具有长到6厘米（约10日龄的幼苗），当它们可以用于饲养小褐飞虱（图2）。
  
  图1.在烧杯中培育水稻幼苗
  
  图2.种植在室内的秧苗
RBSDV感染的稻株的来源 RBSDV感染的稻株（图3）来自山东省济宁市，通过RT-PCR确认RBSDV的存在。使用Trizol试剂从具有症状的叶中提取总RNA。按照提供的说明（Vazyme），使用带有随机引物的逆转录试剂盒进行逆转录。所使用的引物根据RBSDV（S10-Forward：AAC AAC CGA CCA ACA ATC AC和S10-Reverse：GAG CAG GAA CTT CAC GAC AG）的公开的S10的序列设计。具体步骤如下：
1. 逆转录（10μl），此步骤的目的是将RNA逆转录成cDNA。
  1. 使用以下反应去除基因组DNA（在无RNA酶的管中的反应）：
    
    RNase-free ddH2O
    to 8 μl
    
    4x gDNA mix (containing DNase)
    2 μl
    
    Total RNA
    1-500 ng
    
    使用移液器混合溶液，然后在42°C加热2分钟。
  2. 进行如下反转录反应：
    
    5x HiScript II Q Select RT SuperMix
    2 μl
    
    Mixed solution from step B1a
    8 μl
    
    用移液器混合溶液，然后放入PCR仪进行以下操作：
    
    25 °C
    10 min
    
    50 °C
    30 min
    
    85 °C
    5 min
2. PCR扩增
  1. 准备一个混合物如下：
    
    2x HieffTM PCR Master Mix
    5 μl
    
    Forward primer
    0.3 μl
    
    Reverse primer
    0.3 μl
    
    cDNA from reaction above
    0.5 μl
    
    RNase-free ddH2O
    To 10 μl
    
    Mix the solution fully, put it into the PCR machine and set up the following amplification
    
    94 °C
    3 min
    
    94 °C
    30 sec
    
    58 °C
    30 sec
    35 cycles
    
    72 °C
    30 sec
    
    72 °C
    10 min
    
    4 °C
    End
  2. 琼脂糖凝胶电泳
    1. 凝胶的制备：首先，将1克琼脂糖称重到带有蓝色盖的玻璃瓶中。其次，加入100毫升TAE缓冲液，并在微波炉中加热直至完全溶解。
    2. 生产塑料片：将上述琼脂糖凝胶冷却至约65℃后，加入适量的溴化乙锭染料，然后倒入预先插入梳子的透明板中。
    3. 添加样品：首先，将琼脂糖凝胶板放入电泳槽，轻轻移动，排出孔内的气泡。然后，向第一个孔中加入5μlDNA标记，接着将PCR产物依次加入下列孔中。为避免样品之间的交叉污染，请为每个样品使用新的移液器吸头。最后，连接电源并将电压调整到150-180 V.
    4. 观察：当条带正面到达凝胶的一半时，关掉电源，取下平板，轻轻地将电泳缓冲液干燥。然后将凝胶放入凝胶成像系统观察。
      
      图3. RBSDV感染的稻株
繁殖健康的飞虱种群
飞虱完成其生活周期大约需要一个月，其中包括5龄若虫阶段（图4A）和1个成年阶段。第五龄若虫（通过雌性腹部的短黑线识别）具有产卵能力。将成虫转移到新鲜的“武育粳3号”稻苗（100-150只飞虱/烧杯）（图4B），产卵48小时（图4C），然后用刷子除去成虫。一般来说，7-10天后在稻苗上会看到小的白色若虫（图4D）。幼苗上的若虫可以用来获得RBSDV。建议在收集若虫前限制水稻幼苗的浇水。

图4“武育粳3号”水稻幼苗产卵后的成虫飞虱A.飞虱的不同阶段; B.本研究中使用的小猪C.成虫是产卵的; D.孵出第一和第二龄若虫。
水稻黑条矮缩病毒接种
1. 将如程序B所述制备的几种RBSDV感染的稻植物用水洗涤并种植在3L烧杯中。
2. 按照程序C所述制备的第一至第二龄若虫从其饲养的稻植物中收集，并释放到RBSDV感染的稻植物（约150-200株飞虱/植物）上3-5天以获得病毒（图5）。
3. 随后，将飞虱转移至健康的“武育粳3号”水稻幼苗，培养期为10-12天。然后通过使用针对病毒结构蛋白的抗体的斑点免疫结合分析（DIBA）来评估病毒性飞虱的比例（Zhou和Liu，2004; Yang等人，2007）（参见程序E）。
4. 对于RBSDV接种，通过小叶蝉转移飞蛾以测试2-3叶期的幼苗并允许饲养3天。计算转移的数量，以确保每个苗上存在三个毒性成虫。然后将飞虱取出，并在温室中种植幼苗以进行症状观察。
  
  图5.若虫若虫在感染RBSDV的水稻上获得病毒
斑点免疫结合分析（DIBA）为了确定SBPH群体的病毒率，采用DIBA方法检测单个SBPH中的RBSDV。具体步骤如下：
1. 将一个单一的SBPH放入一个新鲜的离心管（500μl）中并加入80μl碳酸盐涂层溶液。然后用牙签捣碎昆虫，吸取2μl上清液到NC膜上。在室温下干燥。
2. 在37℃，50rpm，摇动1小时的条件下，将NC膜浸入含有5％脱脂乳的PBS-T封闭溶液中。
3. 在37°C，50 rpm，摇动2 h的条件下，将NC膜转移至含有抗P10（1：1,000）的封闭溶液中。每次用PBS-T清洗膜3次，每次10分钟。
4. 将NC膜转移至含有辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白G（1：5,000）的封闭液中（37℃，50rpm，振荡1.5h）。每次用PBS-T清洗膜3次，每次10分钟。
5. 用滤纸从NC膜上取下PBS-T溶液，用TMB色底物溶液覆盖NC膜。在黑暗中反应5-15分钟，直到阳性对照显着。
RBSDV接种后的症状评估通过测量植物高度并通过RT-PCR（参见程序B）在转移至温室后30天评估接种的稻秧（步骤D）上的症状。

数据分析

通过RT-PCR鉴定用作来源植物的RBSDV感染的稻植物。图6显示了由S10引物扩增的517bp PCR产物的实例。这些结果表明大多数从田间收集的植物都被RBSDV感染。

图6.从田间采集的十个单独的稻植物通过RT-PCR扩增的带作为用于接种实验的RBSDV的潜在来源。 1-9：RBSDV感染的稻植物; +：阳性对照; - ：负面控制。
经过10-12天的潜伏期后，用DIBA评估病毒性飞虱的比例（图7）。在这个例子中，测试了60只飞虱，其中21只（35％）感染了RBSDV。根据这些结果，八个飞虱被用来接种每个测试水稻幼苗。

图7.用DIBA法测定病毒飞虱的比例。+：阳性对照; - ：负面控制;黑斑，带毒的飞虱。
与对照相比，RBSDV感染的稻植物显示显着的矮化症状（图8A）。用RT-PCR来确认矮化的稻是否被RBSDV感染（图8B）。在这个例子中，测试了所有22个接种的水稻幼苗，并且17个矮化的植物都显示出受RBSDV感染，而其他植物是健康的。 77％的感染率表明，通过温室中的稻飞虱接种RBSDV是可行和有效的。图9说明了SBPH接种RBSDV的整个过程。
＆nbsp;

A.健康的（CK）和RBSDV感染的（RB）植物; B. B.RT-PCR结果显示在22个接种的稻苗中检测到RBSDV。 M：标记; +：阳性对照; - ：负面控制。
＆nbsp;

图9. SBPH接种RBSDV的总体过程

笔记

收集若虫时，要保持水稻幼苗的土壤干燥。

食谱

碳酸盐涂料解决方案
1.59克Na 2 CO 3 3 2.93g NaHCO 3•/ 2 溶于900毫升蒸馏水中，定容至1000毫升（pH = 9.6）
10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）
16克NaCl
4克KCl
4克KH 2 PO 4 4克/克 6克Na 2 HPO 4•12H 2 O O 溶于900毫升蒸馏水中，定容至1000毫升（pH = 7.5）
PBS-T
用1:9体积比稀释的10倍PBS，加入0.1％Tween 20
阻止解决方案
5％（w / v）脱脂奶粉PBS-T
TMB彩色基板解决方案
3毫克4-氯-1-萘酚
2毫升乙醇
7μl30％H 2 O 2 2/2 10毫升PBS
调整pH值到7.5

致谢

我们感谢江苏省农业科学院的周宜军教授和他的团队为我们提供了健康的飞虱，吴建祥（浙江大学）为我们提供了抗体。我们感谢英国Stevenage教授M.J.Adams帮助纠正稿件英文。该协议是从以前的作品，包括张等人的修改。（2001a），Sun等人。（2015年），和他等人。（2017），并已成功用于病毒表征和病毒 - 植物相互作用的研究。所有作者声明没有任何利益冲突。

参考

Boccardo，G。和Milne，R.G。（1984）。植物呼肠孤病毒组。 CMI / AAB，植物病毒描述294号，英联邦微生物研究所和应用生物学协会。英国。
He，Y.，Zhang，H.，Sun，Z.，Li，J.，Hong，G.，Zhu，Q.，Zhou，X.，MacFarlane，S.，Yan，F.and Chen，J.（ 2017年）。茉莉酸介导的防御抑制水稻对水稻黑条矮缩病毒感染的油菜素内酯介导的易感性< / New Phytol 214（1）：388-399。
Li，L.，Li，H.W.，Dong，H.B。，Wang，X.F。和Zhou，G.H。（2010）。由 Laodelphax striatellus 传播水稻黑条纹病毒从冷冻感染的水稻叶片到水稻和玉米的健康植物。 J Phytopathol 159：1-5。
Marzachi，C.，Boccardo，G.，Milne，R.，Isogai，M.和Uyeda，I.（1995）。基因组结构和病毒的变异性病毒学研讨会 6：103-108。
Shikata，E.和Kitagawa，Y。（1977）。水稻黑条矮缩病毒：其性质，形态和细胞内定位。 >病毒学 77（2）：826-842。
Sun，Z.，He，Y.，Li，J.，Wang，X.和Chen，J。（2015）。小RNA对水稻叶和根中水稻黑条矮缩病毒反应性microRNA的全基因组表征和降解组测序。植物细胞生理学 56（4）：688-699。
Yang，J.，Zhang，H.M.，Chen，J.P.and Dai，L.Y。（2007）。水稻黑条矮缩病毒fijivirus p8蛋白原核表达抗血清制备及其性质。 Acta Phyophylacica Sinica 34（3）：252-256。
Zhang，H.M.，Chen，J.P。和Adams，M.J。（2001a）。来自中国的水稻黑条矮缩病毒的片段1至6的分子表征提供了完整的基因组。 Arch Virol 146：2331-2339。
Zhang，H.M.，Chen，J.P.，Lei，J.L。和Adams，M.J。（2001b）。序列分析显示，水稻，小麦和玉米在中国的矮化病是由水稻黑条矮缩病毒引起的。 Eur J Plant Pathol 107：563-567。
Zhou，Y.J。和Liu，H.J。（2004）。由灰飞虱携带的水稻条纹病毒的免疫测定。江苏农业科学1：50-51。