材料和试剂

口腔和牙龈样本采集
1. 超细聚苯乙烯拭子（Puritan Medical Products，目录号：25-800 1PD 50）
2. 安全锁Biopur 1.5毫升单独包装管（Eppendorf，目录号：022600028）
3. KIMWIPES微妙的任务刮水器（KCWW，金佰利专业，目录编号：34120）
4. 无菌手术刀手柄＃3（Fine Science Tools，目录号：10003-12）
5. 手术刀刀片＃10（精细科学工具，目录号：10010-00）
6. 70％乙醇
7. TE缓冲液（Epicentre，目录号：MTE0970）
8. RNase AWAY去污试剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，产品目录号：10328011）
9. 氯胺酮100毫克/毫升（Zetamine CIII，VetOne）
10. 甲苯噻嗪20mg / ml（AnaSed，劳埃德实验室）
DNA分离
1. 安全锁Biopur 1.5毫升单独包装管（Eppendorf，目录号：022600028）
2. DNA IQ旋转篮（Promega，目录号：V1225）
3. DNeasy血液和组织试剂盒（QIAGEN，目录号：69504）
4. Ready-Lyse溶菌酶溶液（Epicentre，目录号：R1810M）
5. 乙醇分子生物学（西格玛奥德里奇，目录号：E7023）
6. RNase AWAY去污试剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：10328011）
16S rRNA基因文库的扩增和可视化
1. DNA低结合管1.5毫升（Eppendorf，目录号：0030108051）
2. DNA低结合管2.0 ml（Eppendorf，目录号：0030108078）
3. PCR管0.2毫升无盖（Bio-Rad Laboratories，目录号：TLS0801）
4. PCR管8-盖条（Bio-Rad Laboratories，目录号：TCS0803）
5. 高保真Platinum Taq DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific，目录号：11304011）
6. dNTP混合物（每种10mM）（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0191）
7. PCR水（QIAGEN，目录号：17000-10）
8. 正向引物8F 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'（Custom order-IDT）*
9. 反向引物361R 5'-CYIACTGCTGCCTCCCGTAG-3'（Custom order-IDT）*
  注：这些通用引物首先在Sundquist等人的文章中描述（2007年）。此外，正向和反向引物都需要包括5'和3'接头序列，异质性间隔区和期望的索引标识符序列，这将允许双重索引以用于稍后的样品识别。在Fadrosh等人的研究中详细描述了这些修改。（2014）。
10. UltraPure琼脂糖（Thermo Fisher Scientific，目录号：16500500）
11. 50x TAE缓冲液（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610743）
12. GelPilot DNA加载染料，5倍（QIAGEN，目录号：239901）
13. UltraPure溴化乙锭（Thermo Fisher Scientific，目录号：15585011）
14. 100 bp DNA梯（New England BioLabs，目录号：N3231S）
15. RNase AWAY去污试剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：10328011）
PCR产物清洁，定量和测序
1. DNA低结合管1.5毫升（Eppendorf，目录号：0030108051）
2. Qubit测定管（Thermo Fisher Scientific，目录号：Q32856）
3. Agencourt AMPure XP（Beckman Coulter，目录号：A63880）
4. 乙醇分子生物学（西格玛奥德里奇，目录号：E7023）
5. 缓冲液EB（QIAGEN，目录号：19086）
6. Qubit dsDNA HS分析试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录编号：Q32851）
7. Experion DNA 1K Kit（Bio-Rad Laboratories，目录号：7007107）
8. PhiX Control V3（Illumina，目录号：FC-110-3001）
9. MiSeq试剂盒v3（Illumina，目录号：MS-102-3003）
10. RNase AWAY去污试剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：10328011）

设备

无菌剪刀（VWR，目录号：82027-582）
无菌精细剪刀（Fine Science Tools，目录号：14058-11）
无菌介质尖端钳（Fisher Scientific，目录号：12-000-157）
移液器
UV交联剂（UV Stratalinker 1800）（Stratagene，型号：1800型）
微量离心机（Eppendorf，型号：5424 R）
Eppendorf管加热摇动块（Eppendorf，型号：Thermomixer 5436）
涡旋混合器（Scientific Industries，型号：Vortex-Genie 2）
分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号：NanoDrop TM 1000，目录号：ND-1000）
热循环仪（Bio-Rad Laboratories，型号：DNA Engine）
电泳室（Bio-Rad Laboratories，型号：Wide Mini-Sub Cell GT Cell）
凝胶成像仪（Syngene，型号：InGenius3）
DynaMag-2磁铁（Thermo Fisher Scientific，型号：DynaMag TM -2磁铁）
自动电泳站（Bio-Rad Laboratories，型号：ExperionTM自动电泳系统）
Experion引发站（Bio-Rad Laboratories，目录号：7007030）
Experion涡流站II（Bio-Rad Laboratories，目录号：7007043）
Qubit 3.0荧光计（Thermo Fisher Scientific，型号：Qubit 3.0）

软件

软件Mothur（Schloss 。，2009）
软件R（R核心团队，2017）
软件RStudio（RStudio团队，2015）

程序

口腔和牙龈样本采集
1. 口腔粘膜微生物群取样
  注意：这个程序允许对来自所有口腔粘膜区域的微生物组进行综合评估。
  1. 无菌添加150微升的TE缓冲液1.5毫升安全锁Biopur管。
    每个鼠标包括一个采样和一个阴性对照
  2. 用70％乙醇和RNase AWAY试剂清洁工作表面。紫外线治疗管，架子，剪刀30分钟。
  3. 根据ARAC指南麻醉或安乐死鼠标注：对于麻醉，我们制备一种由氯胺酮（100毫克/千克）和赛拉嗪（10毫克/千克）组成的液体溶液，通过腹腔注射给药。我们建议在注射之前对每只小鼠称重，进行剂量计算。
  4. 用先前用RNase AWAY试剂沾湿的纸巾擦拭戴手套的手。＆nbsp;＆nbsp;
  5. 打开棉签信封并准备好（单手），抓住鼠标拉动颈部皮肤，使嘴张开而不接触（另一只手）（图1A）。
  6. 擦拭口腔30秒，从舌头开始，然后颊部区域，牙龈，上颚和完成与下切牙牙龈（图1B）。
    
    图1.口腔拭子样本采集A.手柄定位时，处理鼠标进行采样，打开它的嘴而不接触它。 B.擦拭口腔，取样舌头和颊面。
  7. 将拭子置于TE缓冲液中，并用剪刀剪下棉签手柄，以使管子闭合，但不要太短。立即将管放在干冰上。收集阴性对照棉签，拭子并将其暴露于空气中，然后将其放入带TE缓冲液的管中。
  8. 收集所有样品后，将其储存在-80°C直到加工。
2. 牙龈组织样本采集
  注意：该程序允许评估牙龈中的口腔微生物组，并且可能在牙周炎的研究中是最有用的。
  1. 步骤A2a-A2b作为A1a-A1b。
  2. 根据ARAC指南安乐死鼠标。
    注意：对于安乐死，我们将小鼠暴露于合适的室中的CO 2，遵循由Institutional Animal Care and Use Committee，NIDCR / NIH建立的指导方针。
  3. 用先前用RNase AWAY试剂沾湿的纸巾擦拭戴手套的手。＆nbsp;＆nbsp;
  4. 灌注老鼠并解剖组织以暴露口腔（图2A）。这些程序在Dutzan et al 中有详细的解释。（2016）。
  5. 使用＃10刀片，解剖上颌磨牙周围的腭牙龈（图2B）。用镊子取出牙龈组织，并将其置于带有TE缓冲液的管中，将其直接转移到干冰上。作为阴性对照，用TE缓冲液将一对未使用的镊子浸入另一个管中。
  6. 收集完所有样品后，将其储存在-80°C直到加工。
    
    图2.牙龈组织收集A.解剖来自小鼠上颌磨牙周围的腭齿龈组织。 B.切除牙龈组织的放大图。
DNA分离
1. 用70％乙醇清洗工作表面，然后用RNase AWAY试剂清洗。紫外线治疗塑料管架，移液器，无菌镊子和旋转篮（每个样品考虑一双镊子和一个篮子）。
2. 解冻之前收集的样品，将试管置于37°C加热振荡块，中速10分钟。
3. 简而言之，旋转样品管，每管添加1微升ReadyLyse。在中等速度的加热摇动块（37°C）上孵育60分钟。
4. 在打开之前，简单地旋转管。
5. 加入25μl蛋白酶K和200μl缓冲液AL（均来自DNeasy血液和组织试剂盒）。
7. 在温度为56°C的高温摇床上以中等速度孵育
8. 第二天，打开之前，简单地旋转管。
9. 如果样品是牙龈组织，继续步骤B12。
10. 如果用棉签收集样本，从上端用一把镊子抓住棉签，将一个旋转篮子放入管中，然后将棉签放入篮中。
11. 拿着篮子的管子，在上面擦拭，然后短暂地旋转，以排出棉签上的液体。丢弃篮子和棉签。
12. 加入200μl乙醇，涡旋混合。
13. 在打开之前，简单地旋转管。
14. 将混合物吸入先前置于2ml收集管中的DNeasy微型旋转柱（从现在开始，所有试剂均在DNeasy血液和组织试剂盒中提供）。
15. 在≥6,000×g的条件下离心1分钟。丢弃流通和收集管。
16. 将色谱柱置于新的收集管中，加入500μlBuffer AW1。
17. 在≥6,000×g的条件下离心1分钟。丢弃流通和收集管。
18. 将色谱柱置于新的收集管中，加入500μlBuffer AW2。
19. 在20000×g离心3分钟以干燥柱膜。丢弃流通和收集管。
20. 确保色谱柱已经干燥，然后进入下一步，如果它变湿了，使用新的收集管重复步骤B19。
21. 放置一个新的1.5毫升安全锁Biopur管（不包括在工具包），并吸取53微升缓冲区AE直接到膜的中心。
22. 在室温下孵育5分钟
23. 在≥6,000×g的条件下离心1分钟
24. 测量分光光度计（Nanodrop，ND-1000）中的DNA浓度。
16S rRNA基因扩增
来自口服鼠样品（健康/稳定状态）的DNA浓度很低，特别是当使用口腔拭子程序（通常约2-3ng /μl总DNA）时。因此，我们修改了后续PCR反应的方案，无论其DNA浓度如何，每个反应添加4μl。我们还通过增加PCR循环次数（从25到35）和降低退火温度（从52.5℃到50℃）来调整扩增条件。重要的是，我们的非模板控制和水本身并没有放大与此修改的协议。每个样品的所有PCR反应一式两份进行，然后在纯化之前合并PCR产物。
1. 用70％乙醇清洗工作表面，然后用RNase AWAY试剂清洗。
2. 在2ml LoBind管中装配主混合物，根据下述体积（每个管）将所需量的PCR水，dNTP，MgSO 4，Taq聚合酶和缓冲液合并。
3. 通过涡旋充分混合，并将13.6μl的该混合物加入到每个PCR管中。
4. 为每个PCR管添加所需的正向和反向引物（两者都有自己的索引序列，用于“双重索引”）。
5. 将DNA模板添加到每个PCR管。
6. 将管置于热循环仪中并运行以下PCR条件：
7. 将来自一个样品的重复PCR产物合并到一个DNA低结合的1.5ml试管中。然后，用100 bp的梯子进行1.2％的琼脂糖凝胶，用溴化乙锭或您喜欢的DNA染料染色，然后在凝胶成像仪上观察PCR产物。预期的扩增子大小约为528 bp。
使用Agencourt AMPure XP系统清洁PCR产物
1. 用70％乙醇清洗工作表面，然后用RNase AWAY试剂清洗。
2. 将Ampure XP磁性颗粒溶液平衡到室温（15-30分钟）。
3. 在此期间，准备新鲜的70％乙醇，等分所需量的EB缓冲液（考虑每个PCR产物40μl），并准备好一套DNA低结合的1.5ml试管。
4. 测量每种PCR产物的体积。
5. 通过涡旋AMPure XP磁性颗粒溶液混合，重新悬浮任何可能沉降的磁性颗粒。
6. 根据测量的PCR产物体积，根据以下比例（DNA：珠= 1：0.65）添加适量的珠溶液。
7. 短暂地小心涡旋，将混合物保持在管的底部。
  在室温下孵育5分钟，使DNA与珠子结合
8. 将管子放在DynaMag-2磁铁上2分钟，或直到珠子从溶液中分离出来。
9. 在将管保持在磁铁中时，小心地移除上清液。
10. 从磁铁上取下管子，分配200μl的70％乙醇，上下吸取混合。
11. 重复步骤D8和D9。
12. 从磁铁上取下管子，分配200μl的70％乙醇，上下吸取混合。
13. 重复步骤D8和D9。
14. 将试管保持在磁铁中，打开试管盖，让试管干燥约5分钟，确保试管表面不开裂，因为这会导致DNA产量低。
15. 从磁铁上取下管，每管加入40μL的EB，并通过移液混合。
16. 将管放回磁铁，等待2分钟，或直到珠粒清楚地从溶液中分离。
17. 将约35μl的上清液转移至新的低结合量1.5ml管中。
使用Qubit dsDNA HS分析试剂盒进行PCR产物定量
1. 将试剂盒溶液平衡至室温（15-30分钟）。
2. 设置所需数量的样品和标准Qubit测定管（标准品2管）。
3. 标注管盖。
4. 通过在HS缓冲液中稀释HS试剂1：200来准备工作溶液。准备所需的数量，考虑到每个样品将需要198微升和标准190微升。
5. 加入190微升的工作解决方案的标准管，并添加10微升的每个标准的适当管。通过涡旋2-3秒混合，避免气泡形成。
6. 向样品管中加入198μl工作溶液，并将2μl的每个样品加入到相应的管中。通过涡旋2-3秒混合，避免气泡形成。
7. 在室温下孵育2分钟
8. 按照标准校准Qubit荧光计，然后继续阅读样品。
  注意：Qubit dsDNA HS检测试剂盒检测范围从0.5到100 ng /μl是很重要的。低于检测范围的样品可以量化，但其浓度可能不准确。
使用Experion DNA 1K Kit进行PCR产物定量和可视化
我们执行此步骤以确认清洁程序后PCR产物的纯度。目标DNA的大小应该对应于528bp的单个峰。
1. 将试剂盒试剂平衡到室温（15-30分钟）。
2. 在等待的过程中，确保PCR产物的DNA浓度不超过50 ng /μl，如果超过这个值，则稀释到50 ng /μl。对于我们的样本，DNA浓度通常低于这个值。
3. 漩涡短暂旋转所有试剂。
4. 在凝胶管（G）中加入12.5μl染色剂（ST），制备凝胶染色溶液（GS）
5. 涡旋10秒钟，并将GS溶液转移到旋转滤管（在试剂盒中提供）。
6. 将离心过滤管以2,400×g离心15分钟。
7. 放弃过滤器。由于此GS解决方案持续1个月，所以请注明日期。这个解决方案需要避光保存在4°C。
8. 通过添加9μL的GS灌注好的DNA芯片，然后在启动站选择C3，然后按启动。目测检查气泡或不完全启动。
9. 吸取9微升GS到DNA芯片中的其他GS孔（3）。
10. 吸取5μL上样缓冲液到L井和每个样品井（11）。
11. 吸取1μL的DNA 1K梯子进入L型。
12. 吸取1微升的DNA到每个样品井。
  加入1μlTE缓冲液或不含DNase的水
13. 将芯片放在Experion涡流站中，然后按混合。
14. 在Experion电泳站中运行芯片。
PCR产物合并和测序
1. 计算每种纯化的PCR产物的nM浓度。考虑来自Experion分析的扩增子大小（528bp）和使用Qubit从干净PCR产物获得的DNA浓度。
2. 用EB缓冲液将每种PCR产物稀释至4nM。
  为了获得大致相同数量的读数，PCR产物浓度和稀释度准确是非常重要的
3. 每个稀释的PCR产物添加5μL到一个2.0毫升的DNA低绑定管，样品汇集在等摩尔量。如前所述使用Qubit测定法测量文库DNA浓度。在4°C储存。
4. 按照制造商的标准化测序方案，使用PhiX控制文库和Illumina的MiSeq试剂盒v3，可以在MiSeq仪器上对合并的PCR产物进行测序。
5. 根据 MiSeq ®试剂盒试剂准备指南。
6. 考虑到步骤G4中测量的DNA浓度，进行如 MiSeq系统变性和稀释库指南。
7. 对于我们的样品，我们将文库稀释到9pM，并将其与20pM PhiX以一定比例组合，使得我们能够获得14％的PhiX峰值。

数据分析

在测序之后，使用软件Mothur处理数据（Schloss等人，2009）。分析流水线的详细描述可以在我们的原始文章（Dutzan et al 。，2017）中找到。简言之，预处理的初始步骤旨在消除低质量读取，按照大小（200-400bp）组装重叠群和过滤。随后，我们按照MiSeq SOP管道（ https://www.mothur.org/wiki/MiSeq_SOP），如Kozich et al 中所述。（2013年）。经过预处理后，序列被聚类到操作分类单元（OTU）（使用97％的相似性截止值）。对于分类学分类，我们使用适用于Mothur的核糖体数据库项目分类器（Wang et al。，2007），允许将OTUs分类到属级。为了改善OTU的分类鉴定，我们获得每个OTU的代表序列，并使用BLAST将其与NCBI 16S rRNA数据库进行比较。顶级匹配（呈现至少97％的相似性和覆盖率）为每个OTU提供额外的物种级分类信息。
对于数据可视化，我们使用软件R和R工作室，结合R包'ggplot2'和'RColorBrewer'。
为了对样品的分类组成进行概述，我们通常绘制出顶部OTU的相对丰度（平均丰度> 1％）（图3）。可以使用适当的统计测试（考虑数据是否配对，遵循正态分布，等等）来确定相对丰度的差异，并调整多重比较。我们经常使用LDA效应规模（LEfSe）工具（Segata et al 。，2011年）来识别差异代表的OTU，可在 https://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/ 。

图3.来自牙龈组织和口腔粘膜表面的口腔微生物群体中的最丰富的OTU来自10周龄C57BL6小鼠的实例数据（n = 10）。
为了探索社区之间的差异（贝塔多样性），可以使用ThetaYC距离来比较样本，该距离衡量社区整体结构的差异。这些数据可以使用主坐标分析（PCoA）进行分析/可视化（图4）。

图4.基于Theta YC距离的PCoA图表来自牙龈和粘膜组织的样品分别聚集，表明它们具有不同的全球群落结构的微生物组（ P <0.001，测定由AMOVA）。

笔记

在任何时候都要戴手套，实验室外套，并尽可能考虑戴口罩，以尽量减少收集和加工过程中样品污染的风险。

食谱

该协议不需要试剂的配方，几乎所有的试剂都可以使用。

致谢

作者感谢Nicolas Dutzan博士和摄影师Teresa Wild女士仔细阅读本手稿。这项工作是由国家牙科和颅面研究所（NIDCR）（NMM）的校内项目资助的，由BIDRC（BB / M025977 / NIDCR）的NIDCR / NIH拨款R01 DE021578和R21DE023967 1到JEK）和曼彻斯特炎症研究协作中心（JEK）。该协议是根据以前在Dutzan等人发表的方法改编的。（2017年）。作者没有任何利益冲突或竞争利益的申报。

参考

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