材料和试剂

微量离心管，带O形环的螺旋盖（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：3464）
巴斯德吸管
（100×100×15mm，Fisher Scientific，产品目录号：FB0875711A;或更大的120×120mm，来自方形陪替氏培养皿的[14] C-CO 2 CO 2标记室） Fisher Scientific，目录号：07-000-330）
无菌手术刀
用于发芽种子的圆形深井培养皿（100 x 25 mm）（Fisher Scientific，产品目录号：FB0875711）
手术白色多孔胶带（3M，目录号：1530-0）
10毫升注射器（不带针头）（Luer-Lok Tip）（BD，目录号：309604）
1毫升塑料注射器筒（Luer-Lok Tip）（BD，目录号：309628），切成3厘米和柱塞。
注射针，1.5-2.0英寸，18号（Monoject Needle，Covidien，目录号：1188818112）
闪烁瓶（Fisher Scientific，目录号：03-337-15）
双刃剃须刀（PERSONNA品牌，电子显微镜科学，目录号：72000）
塑造黏土（美国艺术粘土）
控制和实验植物材料
碳酸氢钠[14 C] NaHCO 3（MP Biomedicals，目录号：0117441H; 40-60mCi / mmol; 2mCi / ml; 5mCi; 185MBq） br />
次氯酸钠（NaClO）（商业漂白剂）
道康宁高真空油脂
乳酸（85％）（Fisher Scientific，目录号：A162-500）
（例如Bio-Rad Econo-Column，1.5×20cm，Bio-Rad Laboratories，目录号：7371522）中的碱石灰（LI-COR，目录号：9964-090）
乙醇绝对（Pharmco-AAPER，目录号：111000200）
适用于垂直取向培养皿中的植物生长的Murashige和Skoog（MS）培养基（PhytoTechnologyLaboratories，目录号：M404）或其他合成的无菌培养基（参见种子发芽和实验的配方）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S0389）
氢氧化钾（Fisher Scientific，目录号：P250-500）
结冷胶（PhytoTechnology Laboratories，目录号：G434）
Ecolume闪烁液（MP Biomedicals，目录号：0188247004）
含有Suc的半强度Murashige和Skoog（MS）培养基，用于种子发芽（见食谱）
不含Suc的半强度Murashige和Skoog（MS）培养基用于实验（见食谱）

设备

玻璃器皿，天平，搅拌板，pH计，高压灭菌器，水浴器，洁净台，等等。
用于杀菌种子的干燥器（2.5升）（Kimble，目录号：31200-150）
增长控制和实验工厂的环境增长分庭
个人安全设备：实验室外套，丁腈手套（或类似的）和护目镜
适用于光合标记的灯，如400瓦金属卤化物灯（SYLVANIA 64490 - 400瓦 - BT37 - 金属卤化物灯）
通风橱适当的支持金属卤化物灯（参见图1，Yadav等人，2017b）
用于空气循环的超薄型微型鼓风机（可选; Exton PA，Pelonis Technologies，产品目录号：RFB3004;由四个1.5伏D型电池依次供电，以提供6伏电压）
带入口和出口的小型真空泵（例如，Airpo，Barcodable，目录号：UPC 045635496699）
盖革计数器（Ludlum测量，模型：模型3）
剪刀（Fisher Scientific，目录号：08-951-20）
手术刀（精细科学工具，目录号：10003-12）
手术刀片（精细科学工具，目录号：10011-00）
镊子，罚款，如杜蒙罚款点5号（精细科学工具，目录号：11251-10）
平衡（梅特勒 - 托利多，型号：AE100）
微量离心机（GeneMate，目录号：C-1301-PC）
旋转平台摇床（轨道摇床变量，BioExpress，GeneMate，目录号：S-3200-LS）
闪烁计数器（贝克曼计数器，型号：LS 6000IC）
水浴

程序

准备一个适合于[14C] CO_2光同化的工作区
1. 请参考Yadav等人的文章“2017b”，了解如何制备适合用[14C] CO 2同化标记的工作区域。 />
2. [14C] NaHCO 3储备将释放气态[14 C] CO 2 2。为了尽量减少这种情况，商业储备是作为缓冲到pH 9.5的碱性溶液提供的，因为酸性pH促进了转化为CO 2。股票应储存在4°C而不是-20°C，以防止水晶中冻结和[14C] NaHCO 3 3的局部浓度。我们建议用O型圈将样品分装到螺旋盖微量离心管中。
  按照所在实验所的要求，记录库存的接收和使用情况
实验和对照WT萌发拟南芥种子
1. 将每个实验和对照线的30-40粒种子（〜1mg）分装到单独的2ml微量离心管中，并通过标准程序用液体漂白剂在液相或气相中灭菌。实验系的实例可以是具有修饰的转运蛋白基因表达的转基因植物，在这种情况下，对照系将是野生型植物或优选具有相同T-DNA主链但没有修饰的转运蛋白表达的转基因植物。我们通常进行气相灭菌（Clough和Bent，1998）：在通风橱中，将开放的带有种子的微量离心管放置在2.5L玻璃干燥器中，同时装有40ml市售漂白剂的烧杯。用浓HCl快速酸化漂白剂（在带有橡皮球的巴斯德吸管中1-2ml）并密封干燥器盖。让种子在释放的氯气中消毒4-5小时。将种子立即撒在发芽培养基上（用含有1％蔗糖和5g / L结冷胶的Gamborg维生素的1/2强度MS培养基）。
  注意：
  1. 因为拥挤会影响早期幼苗生长和发育，所以避免种子在萌发板上分布不均是至关重要的。我们手动撒种子，以达到均匀分布。
  2. 将种子留在氯气中过久会杀死种子，用这种方法灭菌的种子储存不好。在培养基中的蔗糖提高了发芽和稳定的幼苗建立;以后的步骤使用不含蔗糖的培养基。
2. 在4℃的黑暗条件下将种子分层3天。为了萌发，将板在12μm光照（22℃）/ 12小时黑暗（20℃）昼夜循环下在130μmol光子m 2 -2秒-1下转移到生长室在垂直方向。为了避免污染，在发芽过程中保持板子密封。
3. 准备无菌½强度的MS培养基与甘美维生素和5克/升结冷胶不含蔗糖在方形培养板垂直方向的增长。用培养基填满培养皿一半，一旦凝固，使用无菌手术刀从培养皿的一个边缘无菌地移除1厘米的培养基。当垂直放置时，每个植物的玫瑰花结将在这个切口上方，以便它们不接触介质，并且根将沿着介质的表面放置。不含蔗糖的培养基被用来最好地模拟生理源和宿关系。
4. 发芽后大约4-5天，当根长约1厘米时，将幼苗从发芽板转移到方板上。用细钳子（例如，杜蒙特＃5）轻轻地将幼苗从子叶下面提起，而不会夹住或刺破下胚轴并且不损伤根部。将根部放置在方形平板中介质切割边缘下方3-4厘米的位置，并从子叶下拖曳幼苗以使根部伸直。将幼苗定位，使根部留在培养基上，下胚轴和花环高于培养基的切割边缘。
  注意：每个方形培养皿都是独立的[C] 标签室。因此，控制和实验工厂应该在同一个房间里一起生长。在100×100mm平板中，我们通常生长9个植物：3个对照植物和3个每个2个实验线，顺序在6个重复平板中交替。较大的盘子将容纳更多的植物。标签室也可以由容器制成，例如经过消毒的熟食容器（Yadav等人 em>。em>。，2017b）。
5. 使用多孔手术胶带密封正方形板，并将板放置在垂直（垂直〜15°）附近以保持根部向下生长，但也与介质表面接触。在与上述相同的条件下将平板放置在生长室中。取决于实验，用4-7天的CO 2标记将在4-7天内进行，当根已经延伸〜3cm以覆盖〜75-80介质的长度，或以后，如果使用较大的平板或生长缓慢。
  标签应该在根到达底部之前完成
光合标记
1. 拍摄标签以记录标签发生的日期。在标记前一个小时，在通风橱中打开400W的金属卤化物灯，使其达到约130μmol光子m 2•s -1的稳定强度工作表面。
2. 在标记之前使金属卤化物灯下的植物适应约30分钟。取下外科胶带，但将盖子留在原位。
  注：光合作用，碳分配到不同的代谢库，长途运输到汇器官在整个昼夜周期中波动。为了保持一致性，我们通常在光照期间标记6小时。可以在光照下安装六块板，获得相同的光照强度，但必须注意确保标记的板数不超过在后续步骤中有效处理植物材料的能力。表1提供了一个调度模板。
  对于每个要贴标签的印版，准备一个新标签在标签中使用：在每个盖子的顶部做两个孔，但是在相对的两端注入和排出标签[14C] CO _{2 。注入孔应位于花环附近的顶部，排气孔应位于根部附近的底部。用本生灯加热的回形针末端效果很好。用注射器筒装满真空油脂并且没有针头，在每个盖子内部涂上一层真空润滑脂以密封标签室。使用一个造型粘土的小球来覆盖注入和排出孔（图1B）。
  C 2 在小型电子设备（例如，Pelonis Technologies目录号RFB3004）中通常使用的小型鼓风机可以被定向在贴标签腔室内以将空气吹过工厂。我们通常使用Scotch Removable Mounting Putty将鼓风机固定在燃烧室的顶部或侧面，通过用于密封燃烧室顶部和底部半部分的真空润滑脂形成电线。电池由D型电池供电。在有更多植物的大房间里，循环更重要，我们不使用鼓风机100 x 100毫米。
  
  表1.组织标记和处理六个室的时间表模板，用于远距离从韧皮部到源器官的韧皮运输}
3. 取下要贴标签的第一块板的盖子，并用装有注入孔和排气孔的盖子替换，并涂上一层真空脂。目视确认真空油脂密封完成。
4. 为了产生用于标记的[14 C] CO 2 2，移取2.5μl的[14 C] NaHCO 3（ 2μCi/μl，2mCi / ml）在注射器针筒的注射器针接头附近的液滴中切割成〜3cm。将15μl80％的乳酸液滴放入桶中，注意将液滴与[14C] NaHCO 3液滴分开。轻轻地将柱塞插入桶内（图1C）。将针穿过培养板的注射孔进行标记（去除粘土塞或推到
  侧面），并在其周围安排造型粘土;弯曲45°的针效果良好（图1D）。注入孔的位置和泥塞的大小不应阻挡光线到达玫瑰花结。确保排气孔也被覆盖。在这些步骤中保持[14 C] NaHCO 3和乳酸的液滴分离。轻轻推动柱塞，将乳酸与[14 C] NaHCO 3混合并释放[14 C] CO 2 2， /子>。将柱塞来回移动，将[14C] CO 2气体泵入贴标签室;避免将液体注入腔内，因为乳酸会损害植物。
  拆下针头并用注塑粘土盖住注射孔。
5. 允许植物在[14 C] CO 2存在下进行光合作用20分钟。这是'脉冲'阶段（图1E）。
6. 当第一个室中的植物被贴上标签时，用预先准备好的带有注入和排出孔的盖子以及一个真空油脂珠子来替换第二个培养皿的盖子，并通过肉眼观察确认密封完成。，重复步骤C3和C4），并按照步骤C5中的描述进行标记。重复第三个培养皿， etc 。
7. 注入14C] CO 2 20分钟后，使用排气孔通过碱石灰排出室，并捕获未同化的[14 C] CO 2 （图1F）。一个充满了苏打石灰和连接到一个小型气泵的柱子效果很好。在通过碱石灰通气5分钟后，取下标签过程中使用的盖子，并更换原始盖子，以便与未标记的空气进行气体交换。不要试图用医用胶带重新盖上盖子，但植物应该保持被覆盖，因为它们是在培养皿的高湿度下生长的。让光合作用继续提供40分钟的“追逐”时间。
  注：为确保苏打石灰有效地捕获未同化的[14C] CO 2，它应该是新鲜的并在使用之间保持良好密封。旧苏打石灰应作为14 C标记的干废物
  丢弃
  
  图1.标记在[14C] CO 2/2培养平板上生长的植物的实验程序A.拟南芥从发芽培养基转移大约7天后，用5g / L结冷胶固化的无蔗糖强度MS的无蔗糖固体;前三个是一个实验线，中间三个是控制线，最后三个是第二个实验线。复制板将有不同的顺序。请注意，1厘米的培养基被删除和植物的排列，使芽和下胚轴高于培养基和根生长在培养基的表面。该板在15°的垂直位置上生长。 B.为了将培养板转化为贴标签室，用于注射（顶部）和排气（底部）的具有两个用于14C] CO 2的孔的第二盖是准备一个真空脂的珠子，用培养皿的底部密封。 C.将1毫升注射器筒切成约3厘米（切割端未显示），弯曲45°的针和一小滴[14 C] NaHCO 3（由上部白色箭头指示）和更大的85％乳酸液滴（较低的白色箭头）。柱塞尚未插入。 D.插入穿过贴标签腔的上部注射孔的针，插入柱塞并混合[14 C] NaHCO 3和乳酸。请注意，注入孔和排气孔都是密封的。 E.让植物光合作用20分钟。 F.从注入孔和排气孔中去除粘土，并使用连接到一个碱石灰柱和一个小型空气泵的聚乙烯管来排空该腔室5分钟。 G.把原板放回原位，但不要密封。允许植物在常规空气中进行光合作用，运输光合同化物40分钟（在室内抽空5分钟，在常规空气中抽35分钟）。 H.从根尖到根的长度标记（例如，0.0-1.0厘米，1.0-2.0厘米，等等）。 I.使用剃刀刀片（如图所示）或精细剪刀切割切片，并转移到含有80％乙醇的闪烁小瓶中以停止代谢反应并提取代谢物。或者，可以将来自每种基因型的切片汇集在一起用于闪烁计数的闪烁小瓶中。每个平板应该被认为是一个单独的标记实验（即一次重复），并且实验样品应该在对重复进行统计之前对照对照进行标准化。
收集组织（根和芽）和闪烁计数
1. 使用精细的剪刀或剃刀刀片根据需要切成根部分的实验。我们通常把整个根作为一个单一的异养器官从根部切下，或者把根切成三个区域：距尖端0.0-1.0厘米（这是最活跃生长和最强的水槽），1.0-2.0厘米，剩下的根（这也将包括新兴的侧根）。保留拍摄闪烁计数。
2. 收集根部组织的不同部分和标记的射线到闪烁小瓶中的500μl80％乙醇中以终止代谢并提取代谢物。每个植物的根部和枝条可以分别收集和计数（优选的，但用尽大量的闪烁小瓶）或每个板的每行的组织可以汇集，每个板的样品分别计数。在振荡器上轻轻搅拌闪烁瓶约1小时以提取色素和代谢物;较大的玫瑰花瓣可能需要更大体积的80％乙醇（〜1毫升或更多）。添加500μL商业漂白剂，以破坏可能阻碍闪烁计数的颜料。加入足够的闪烁液并充分混合，得到清晰的单相溶液; 5-10体积的闪烁液到1体积的乙醇/漂白剂溶液应该足够了。测量每分钟的计数或分解

数据分析

每个方形培养板构成独立的标记实验，并且由于难以控制的效应，板之间的光合作用可以在板之间变化。例如，由于板材中的植物在准备标记时仍在继续进行光合作用，因此当板材中的大气“冷”CO 2的量随板材的不同而不同时，注入14 C [CO 2]。这在实验的脉冲阶段改变了特定的活性。为了控制这一点，在每个标记室中包括对照植物，并且相对于这些对照表达相对于实验植物的14C [CO 2：]掺入。也就是说，从每个平板中的实验植物获得的值被标准化为同一室中对照的百分比值。然后将来自不同平板的标准化值作为独立的重复进行组合。这消除了板的标记效率的板变化，以提供对照和实验植物之间的光同化和运输的差异更准确的代表。此外，为了控制板中的微环境效应，控制和实验植物的顺序在重复室之间改变。

食谱

半强度Murashige和Skoog（MS）培养基，含蔗糖，用于种子发芽将2.22g MS溶于800ml ddH 2 O中加10克蔗糖，使其完全溶解
使最终量1000毫升

用1N KOH调节pH值至5.8 加入5克结冷胶，混合溶液
液体循环高压灭菌20分钟
让介质在55°C水浴中冷却15-20分钟
倒入100 x 25毫米的圆形培养皿
用于实验的半强度Murashige和Skoog（MS）培养基
将2.22g MS溶于1000ml ddH 2 O中
用1N KOH调节pH值至5.8 加入5克结冷胶，混合溶液
液体循环高压灭菌20分钟
让介质在55°C水浴中冷却15-20分钟
倒入100×100毫米的方形板

致谢

该协议基于（Dasgupta等人，2014; Khadilkar等人，2016年）中公布的方法。在B.G.上进行韧皮部装载和长途运输。 Ayre的实验室由美国国家科学基金会0344088,0922546,1121819和1558012支持。作者报告没有利益冲突或利益冲突。

参考

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Clough，S.J。和Bent，A.F。（1998）。花蘸：土壤杆菌介导的转化的简化方法> Arabidopsis thaliana 。 Plant J 16（6）：735-743。
Dasgupta，K.，Khadilkar，A. S.，Sulpice，R.，Pant，B.，Scheible，W. R.，Fisahn，J.，Stitt，M.和Ayre，B. G.（2014）。在伴侣细胞中特异性表达蔗糖转运蛋白cDNA增强了韧皮部负载和蔗糖的长距离运输，但是导致到抑制生长和磷酸盐限制的感知。植物生理学165（2）：715-731。
Khadilkar，A. S.，Yadav，U. P.，Salazar，C.，Shulaev，V.，Paez-Valencia，J.，Pizzio，G.A.，Gaxiola，R.A。和Ayre，B.G。（2016）编码质子泵送焦磷酸酶的AVP1的组成型和伴随细胞特异性过表达增强生物量积累，韧皮部装载和长途运输。植物生理学 170（1）：401-414。
Stadler，R.，Lauterbach，C.和Sauer，N.（2005a）。绿色荧光蛋白的细胞间移动揭示了韧皮部外韧皮部的外部运动，在拟南芥种子和胚胎中的共质结构域。植物生理学139（2）：701-712。
Stadler，R.，Wright，K.M.，Lauterbach，C.，Amon，G.，Gahrtz，M.，Feuerstein，A.，Oparka，K.J。和Sauer，N.（2005b）。 GFP融合蛋白在拟南芥伴侣细胞中的表达揭示了非特异性蛋白将其转变成筛分元素，并在根中鉴定出一种新的韧皮部后代结构域。 Plant J 41（2）：319-331。
Yadav，U. P.，Khadilkar，A. S.，Shaikh，M. A.，Turgeon，R.和Ayre，B. G.（2017a）。量化[14C]蔗糖对叶片韧皮部负载的能力。 Bio Protoc 7（24）：e2658。
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