材料和试剂

移液器吸头（Fisher Scientific，Fisherbrand TM，目录号：02-707-404; 02-707-430; 02-707-432）
美国安全剃刀Personna™TM Pal单刃刀片（AccuTec刀片，目录号：620177）
Falcon组织培养皿（Corning，Falcon ，目录号：353002）
Falcon15ml锥形离心管（Corning，Falcon ，产品目录号：352099）
40μm细胞过滤器（Corning，Falcon ，目录号：352340）
1.7毫升微量离心管卡扣管（Corning，Costar ®，目录号：3621）
超低附件96孔板（康宁，目录号：3474）
0.2μm过滤器（Corning，目录号：431219）
10毫升血清移液器（康宁，目录号：357530）
60毫升注射器（BD，目录号：309653）
微盖玻璃（VWR，目录号：48393-081）
木瓜蛋白酶（Worthington Biochemical，产品目录号：LS003119）
10x红血细胞裂解缓冲液（Thermo Fisher Scientific，eBioscience TM，产品目录号：00-4300-54）
台盼蓝溶液，0.4％（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：15250061）
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：D1306）
抗体
1. 抗CD24 PE-缀合的（BD，BD Biosciences，目录号：560991，工作稀释度1:10）
2. 抗CD34 PE-缀合的（BD，BD Biosciences，目录号：550619，工作稀释度1:10）
3. 抗CD45 PE-缀合的（BD，BD Biosciences，目录号：555483，工作稀释度1:10）
4. 驴抗兔Cy3结合（杰克逊免疫研究，目录号：711-165-152，工作稀释度1：250）
5. 驴抗大鼠AF647结合（杰克逊免疫研究，目录号：712-605-153，工作稀释度1：500）
6. EGF配体-AF647缀合（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：E35351）。
7. 山羊抗小鼠-AF488 IgM，μ链特异性（Jackson ImmunoResearch，目录号：115-545-075，工作稀释度1：500）
8. 小鼠抗O4（Millipore Sigma，目录号：MAB345，工作稀释度1：200）
9. 兔抗TuJ1（Covance，目录号：PRB-435P，工作稀释度1：1,000）
10. 大鼠抗GFAP（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，产品目录号：13-0300，工作稀释度1：1,000）。
层粘连蛋白1mg / ml（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：23017015）
Aqua-Poly / Mount（Polysciences，目录号：18606-20）
氢氧化钠（NaOH）（Fisher Scientific，目录号：S392212）
JustPure PIPES（Fisher Scientific，目录号：BP292450）
注：此产品已停产。
D-葡萄糖（Fisher Scientific，目录号：D16-1）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333-500G）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S271-1）
超纯蒸馏水（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：10977023）
酚红溶液，0.02％（Fisher Scientific，目录号：S25464）
抗生素 - 抗真菌药100x（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15240062）
L-半胱氨酸盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：C1276-10G）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Fisher Scientific，目录号：BP118-500）
脱氧核糖核酸酶I（DNase I）（Worthington Biochemical，目录号：LS002139）
胰蛋白酶抑制剂卵类粘蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：T9253-250MG）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH7.4（Fisher Scientific，目录号：BP665-1）
Percoll（MP Biomedicals，目录号：0219536925）
牛血清白蛋白（BSA）（Fisher Scientific，目录号：BP9704100）
1x Hank平衡盐溶液（HBSS），不含钙，不含镁（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：14175103）
B-27补充物（50x），无血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：17504044）
N-2补充物（100x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：17502048）
L-谷氨酰胺（200mM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25030149）
100x胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒（ITS-X）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：51500056）
Dulbecco改良的Eagle培养基/营养混合物F-12（DMEM / F-12）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：11320082）
人重组碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（STEMCELL Technologies，目录号：78003）
人重组表皮生长因子（EGF）（STEMCELL Technologies，目录号：78006.1）
16％多聚甲醛（PFA）（Alfa Aesar，目录号：43368）
正常驴血清（NDS）（Jackson ImmunoResearch，目录号：017-000-121）
将1M HEPES（4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15630080）
Triton X-100（Fisher Scientific，目录号：BP151-500）
10N氢氧化钠（NaOH）（见食谱）
1 M PIPES（见食谱）
10倍氯化钠（NaCl）/氯化钾（KCl）（NaCl / KCl）盐溶液（见食谱）
30％的D-葡萄糖溶液（见食谱）
1 N NaOH（见食谱）
PIPES解决方案（请参阅食谱）
激活木瓜蛋白酶的解决方案（见食谱）
10毫克/毫升DNase I溶液（见食谱）
7毫克/毫升卵类粘蛋白（见食谱）
10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
22％Percoll解决方案（见食谱）
10％牛血清白蛋白（BSA）（见食谱）
1％BSA / 0.1％葡萄糖/ 1倍HBSS（见食谱）
1x PBS（见食谱）
神经球媒体（见食谱）
表皮生长因子（EGF）（20μg/ ml）（见食谱）
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（20μg/ ml）（见食谱）
10％正常驴血清（NDS）/0.5% Triton X-100（见食谱）
1％正常驴血清（NDS）/0.25% Triton X-100（见食谱）
4％多聚甲醛（PFA）（见食谱）

设备

生物安全柜（Labconco，型号：Class II，Type A2）
P2 pipetman（Gilson，目录号：F144801）
P20 pipetman（Gilson，目录号：F123600）
P200移液器（Gilson，目录号：F123601）
P1000移液器（吉尔森，目录号：F123602）
电动移液器控制器（Accupet，目录号：PH01）
毫克平衡（Sartorius，型号：Entris 323）
Minidizer杂交炉（UVP，型号：HB-500）
37℃，5％CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Heracell TM 150i）
冷冻离心机（Eppendorf，型号：5804 R）
血细胞计数器室（Hausser Scientific，目录编号：3110）
水浴（Fisher Scientific，型号：Isotemp 2340）
Thermo Scientific TM Nunc TM Lab-Tek室幻灯片系统（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号号码：178599）
荧光激活细胞分选仪（BD，型号：FACSARIA TM III）
倒置显微镜（Motic，型号：AE20）
共聚焦显微镜（蔡司，型号：LSM 710）
烧杯（Fisher Scientific，产品目录号：FB10050，FB100100，FB100150）
高压灭菌器（Getinge，型号：PACS 2000）

程序

新鲜脑组织解离成单细胞悬液
注意：
1. 组织处理和FACS在生物安全级别（BSL-2）层流罩中进行，对于血源人类病原体使用通用预防措施。在批准的IRB协议下，收集所有的组织并进行鉴定。
2. 建议将组织/细胞尽可能保存在冰上，除非特定的孵化步骤另有说明。
1. 在冷的新鲜制备的PIPES溶液中收集新鲜的脑组织（GM尸体解剖或GBM手术切除）（见食谱）。
2. 将木瓜蛋白酶溶解在活化溶液中（每50-200mg组织用0.003g木瓜蛋白酶溶解1ml活化溶液）（参见注释7）。
  注意：在组织培养之前，木瓜蛋白酶必须在室温下活化至少20分钟但不超过30分钟。
3. 机械消化
  在木瓜蛋白酶活化的同时，用含有少量冷PIPES溶液（1-2ml）的小培养皿中的刀片将组织切碎，直至组织细碎（图1A）。切碎的过程不应超过5分钟。一旦组织被切碎，培养皿应放置在冰上。
  
  图1.新鲜人脑组织解离A.在加入木瓜蛋白酶之前使用剃刀刀片机械组织解离。 B.使用木瓜蛋白酶进行酶解组织解离，离心后产生细胞沉淀。 C.游离组织研磨后形成的细胞悬液。 D.将细胞悬液分层到22％Percoll溶液上。 E.在22％Percoll中温和离心后从细胞外碎片中分离细胞。
  髓鞘和其他细胞外碎片包含在上清液（上），而活细胞沉淀（下）。
4. 将切碎的组织转移到15ml Falcon管中，并添加额外的冷PIPES溶液至9ml。加入1毫升活化的木瓜蛋白酶，终体积为10毫升（木瓜蛋白酶终浓度为300微克/毫升）。
  注意：木瓜蛋白酶消化液（总共10毫升）= 0.003克木瓜蛋白酶+ 1毫升活化液+ 50-200毫克组织在9毫升冷PIPES。
5. 酶消化
  用旋转的培养箱（摇动速度：12rpm）在37℃下用活化的木瓜蛋白酶孵育组织13分钟。在第一个5分钟后，加入50μlDNase I（10mg / ml，参见食谱），通过摇动混合消化组织，然后在37℃重新孵育剩余的8分钟。
6. 在冷藏离心机中离心消化组织，10分钟，310℃×4℃。
7. 停止酶消化
  离心后，将有一个细胞颗粒（图1B）。轻轻倒出上清液，注意不要打扰可能松散的颗粒。用另外的50μlDNAseI（10mg / ml）和100μl木瓜蛋白酶/胰蛋白酶抑制剂（卵类粘蛋白）（7mg / ml，参见食谱）将细胞重悬于1ml冰冷的DMEM / F-12中。 />
8. 单细胞悬液
  首先用P1000移液管连续研磨细胞团，直到没有可见的组织块（视频1）。然后，用P200移液管研磨约50倍，或直到获得没有可见碎片的黑色均质细胞悬液（图1C）（视频2）。避免起泡。
  
  视频1
  
  视频2
9. 消除细胞外碎片
  添加4毫升冷的22％Percoll溶液到新的无菌15毫升管（每个样品两管）。取大约一半的细胞悬液（〜650μl）并将其铺在Percoll的顶部，以连续的逐滴方式进行，以尽可能地防止细胞悬液和Percoll溶液之间的混合（参见食谱和注）（视频3）（图1D）。将剩余的一半细胞悬液与4ml冷的22％Percoll（将每个细胞悬液样品分成两个Percoll管）一起放入另一个管中。
  注意：在添加细胞悬液时倾斜Percoll管45°可能有助于防止混合。
  
  视频3
10. 在4°C的冷冻离心机中以594克xg离心10分钟，同时设置“不制动”或“自由减速”。
11. 离心后，髓鞘和其他细胞外和纤维状碎片将被包含在Percoll上清液中，而完整的细胞将在管底部沉淀（图1E）。仔细滗析整个上清液，并重悬在450微升冷1％BSA / 0.1％葡萄糖/ 1倍HBSS（见食谱）每粒。将每两颗重新悬浮的颗粒（在步骤A9期间分开）重新组合成新的15ml Falcon管。
12. 消除红血细胞：
  加入100μl（10x）红血细胞溶解（RBL）缓冲液并在室温下孵育10分钟。
13. 清洗RBL
  红细胞裂解后，加入9ml冷的1％BSA / 0.1％葡萄糖/ 1x HBSS，并在4℃以310×g离心5分钟。
14. 计数活细胞
  滗析上清液并用550μl冷的1％BSA / 0.1％葡萄糖/ 1×HBSS重悬细胞沉淀。在血细胞计数器中使用台盼蓝排除计数活细胞的数量。将5μl台盼蓝与5μl样品混合，并在血细胞计数器室中加载，以在显微镜下计数排除台盼蓝的活细胞。计算原液中活细胞的数量。
15. 用于FACS的配体和抗体孵育：
  1. 将每种单一颜色/无颜色对照（每种约30μl）分出总细胞悬液的5％，并将剩余的细胞悬液用于实验样品。
  2. 对于实验样品，添加EGF-Alexa Fluor 647配体（5μg/ 10 6活细胞）和排除抗体标志物（抗CD24-PE，1:10;抗CD34-PE，1:10 ;抗CD45-PE，1:10）到相同15-ml管中的剩余细胞悬液（约450μl）中。轻轻地搅拌，轻轻搅拌。
  3. 对于单一颜色的对照，只使用相同的配体，在每个30微升（5％）的细胞悬液中加入EGF-Alexa Fluor 647配体或CD24-PE / CD34-PE / CD45-用于实验样品的抗体稀释液。对于无颜色（仅限DAPI）的对照，将30μl等分试样在冰上孵育而不添加任何物质，仅在步骤A18期间添加DAPI。
16. 冰上孵育30分钟，在黑暗中。
  在第一个15分钟后，轻轻地轻轻搅拌
17. 洗涤未结合的抗体/配体
  用10毫升冷的1％BSA / 0.1％葡萄糖/ 1倍HBSS清洗所有试管，并在310℃4℃下离心5分钟。
18. 滗析上清液，并将细胞沉淀重悬于1ml含1％DBSI（1：1,000）的冷1％BSA / 0.1％葡萄糖/ 1x HBSS中。
19. 实现单细胞悬浮，并尽量减少结块：
  将溶液通过一个40微米的过滤器。
荧光激活细胞分选（FACS）
注意：分类过程中的技术支持强烈建议未经培训的人员。
1. 按照Tome-Garcia et al 中描述的门控程序门和分选细胞。（2017）和图2中。每个实验都应该执行没有颜色（仅限DAPI），单色和荧光减去一种颜色（如果使用两种以上颜色）的对照，以建立特定的阴性/阳性截止值细胞群体测试，并确保一致性。
  
  图2.通过FACS从新分离的GM和GBM组织中分离EGFR +细胞为了消除组织碎片（A）（GBM样品），在FACS期间连续选通的代表性实例排除细胞双联体（B和C）（GBM样品），使用DAPI（D和F）（分别为GBM和GM样品）去除死亡细胞，并使用CD24 / 34/45抗体混合物（E和E）排除室管膜/成神经细胞/内皮/ G）（GBM和GM样本，分别见附注6）。在GBM中，但不是在GM中，活细胞的子集显示DAPI荧光（DAPI low ）（D）的转变。 EGFR + DAPI低位GBM群体含有大部分具有干细胞特性的细胞（Tome-Garcia等人，2017）（另见注释）。使用紫色-A，PE-A和APC-A滤光片分别显现DAPI，结合的CD24 / 34/45-PE抗体和结合的EGF-AF647配体。
2. 在适当的门控之后，收集EGF-结合的（即，EGFR +）活的（DAPI-和DAPI低）细胞用于分子或功能下游分析。对于细胞培养，将细胞收集在含有补充有EGF（20ng / ml）和bFGF（20ng / ml）的无菌和新鲜制备的神经球培养基（参见配方）的1.5ml微量离心管中。
  注意：在没有配体补充的情况下，也会观察到神经球的生长。
体外干细胞行为的功能验证
注意：对于所有的GBM肿瘤，建议进行培养验证，因为在极少数情况下，没有明确定义的EGFR +群体的肿瘤可能在正面和负面部分显示球体生长（Tome-Garcia等，2017） em>
1. 将细胞以10个细胞/μl（200μl/孔）的克隆密度（Pastrana et al。，2011）在96孔低附着板中以最少的三个重复孔进行接种。让细胞形成神经球一周，然后每隔三天更换一次培养基（仅替换介质体积的〜1 / 3-1 / 2，小心地从孔的边缘去除而不干扰神经球）。接种1周后，可在倒置显微镜下检查神经球形成情况。考虑让细胞生长12-21天或直到神经球达到至少40微米的直径，然后将它们传递到次级神经球或测试其分化的多能性（图3）。
  
  图3.急性分离的EGFR +和EGFR-GM和GBM细胞的干细胞特性的体外功能分析A-B。 FACS分离的EGFR +和EGFR-原代细胞以克隆密度（10个细胞/μl）接种。（B）在GM EGFR + / EGFR-群（A）中和第12天，在接种的第6天评估神经球形成。 C.使用免疫荧光，使EGFR +细胞显示分化成星形胶质细胞（GFAP +，白色）的原代GM神经球的三系分化的说明;神经元（TuJ1 +，红色）和少突神经胶质（O4 +，绿色）谱系。 DAPI（蓝色）用于复染细胞核。神经球图片放大倍数为10倍。图片已经从Tome-Garcia et al。，2017改编。比例尺= 20微米。
2. 为了区分神经球，用200μL移液管拿起单个神经球，并将其种在层粘连蛋白涂层的室上。让神经球粘附层粘连蛋白4-5小时在37°C细胞培养箱。一旦连接，删除旧的神经球媒体，并添加新的神经球媒体没有B27，EGF，bFGF生长因子补充。让神经球在37°C细胞培养箱中分化1周，不改变培养基。
  注意：在神经球接种之前，Lab-Tek室应该用层粘连蛋白（10μg/ ml）预包被，在37℃下孵育过夜，然后用1x PBS。
3. 分化1周后，用4％PFA溶液（参见食谱）固定细胞，室温下10分钟。用1x PBS洗细胞（见食谱），三次。
4. 为了进行免疫荧光研究，用封闭溶液（10％正常驴血清（NDS）/0.5% Triton X-100）（见食谱）孵育分化细胞，室温1小时，然后与1％NDS中的一抗/0.25% Triton X-100（见食谱），在4℃过夜。用1x PBS洗涤3次，每次5分钟，并在室温下4小时，在1％NDS / 0.25％Triton X-100（参见配方）中与种类合适的荧光染料结合的二抗孵育。用1x PBS清洗二次抗体，每次5分钟，用DAPI（1：1,000）复染，并用Aqua-Poly / Mount水性固定介质进行安装。
5. 具体而言，对于O4，在活的未固定的细胞上进行免疫荧光。孵育细胞与初级抗O4抗体，在4°C 40分钟，用DMEM / F-12培养基洗三次，每次室温5分钟，并与抗小鼠IgM二抗孵育，在4°C孵育40分钟。用DMEM / F-12培养基在室温下每次洗涤5次，每次5分钟，用4％PFA溶液固定细胞10分钟。
6. 检查GFAP（星形胶质细胞），TuJ1（神经元）和O4（少突胶质细胞）在共聚焦或落射荧光显微镜下（图3C）的免疫反应性。

数据分析

为了确保神经球和分化测定中的统计学显着性和重现性，所有实验以三个技术重复进行，并且重复至少三次独立的时间。为了确定EGFR +和EGFR-细胞群体之间的神经球数量的统计学显着性，应用未配对的双尾Student's检验。

笔记

由于在手术缺血或死后时间较长的组织中细胞活力可能较低，应将样品从大脑中取出后立即浸入新鲜制备的（同一天）冷PIPES溶液中，浸入PIPES的样品应保持冷冻（在冰），直到它可以在实验室处理。
根据胎龄和死后时间，人胚胎基质标本显示出广泛的活细胞产量（总细胞中有8.9％-96％的DAPI-活细胞）和EGFR +细胞（总有活力细胞的1％-25％）。此外，人类GBM样品还表现出广泛的活细胞产率（36％-99％）和EGFR +细胞（总活细胞的1.3％-77％），这也归因于胶质母细胞瘤样品的内和分子间异质性到术后缺血时间。有关上述不同变量下EGFR +细胞百分比的详细信息，请参阅原始报告（Tome-Garcia et al。2017）中的补充图1。
EGFR +和EGFR-群体的门控可影响干细胞分离的选择性。尽管我们建议遵循图2所示的门，但是对于单个样品可能需要进行一些修改。特别是，对于GBM分选，DAPI-和DAPI低细胞的比例可以是相当可变的，这取决于细胞非整倍性，手术后缺血时间以及具有干细胞特性的神经胶质瘤细胞的百分比组织样本。根据我们的经验，大多数具有干细胞特性的肿瘤细胞被捕获在DAPI低（EGFR +）群体中，尽管偶尔的DAPI-（EGFR +）细胞也在一些肿瘤样品中显示球形成。因此，根据特异性或灵敏度是否是下游分析的优先级，用户可以选择将DAPI与DAPI low分开，或者将两者组合如图2所示。
用于FACS分离形成球形的人胶质瘤群体的EGF配体的使用已经很好地用于从头部胶质母细胞瘤的切除，其中大多数甚至当未检测到EGFR扩增时显示EGFR的表达。该方法可能不适用于复发肿瘤以及缺乏显着EGFR表达的那些肿瘤（Tome-Garcia等，2017 [图S2]），并且尚未在低级别胶质瘤中进行检测。
在早孕期（<18周）的生发基质组织中，已经在EGFR-群体中观察到罕见的小球形成，其不能进行三系分化（Tome-Garcia等人， 2017 [图S2]）。
在以上和先前公开的（Tome-Garcia等人，2017）上述概述的实验中，CD24被用作GM分类中的成神经细胞和室管膜细胞的排除标志物，并且还被包括在GBM中为了模仿GM和GBM之间的FACS条件。在GBM排序中包含CD24是可选的，但省略它还没有完全测试。
处理组织的重量可能会有所不同，这取决于GM孕龄和GBM切除的程度。在我们的实验中，我们基于50-200mg组织的范围校准了木瓜蛋白酶浓度。如果使用超过200mg的组织，我们在另外的木瓜蛋白酶溶液（每50-200mg另外的组织0.003g木瓜蛋白酶）中消化另外的组织。我们大多数加工的样品起始重量约为300毫克。为了处理小于50毫克的组织，木瓜蛋白酶浓度可能需要优化。

食谱

10N氢氧化钠（NaOH）
20克NaOH颗粒

用超纯蒸馏水将体积加到50毫升注意：作为一项预防措施，使用烧杯并在此过程中保持在冰上。
1 M哌嗪-N，N'-双（2-乙磺酸）（PIPES）
1. 将30.22克PIPES溶于90毫升超纯蒸馏水中
2. 加入NaOH颗粒直至pH值达到6.7 逐滴添加10 N NaOH达到pH 6.9。
3. 用超纯蒸馏水将体积加到100毫升
4. 使用0.2μm过滤器过滤
5. 10倍氯化钠（NaCl）/氯化钾（KCl）（NaCl / KCl）盐溶液
  3.5克氯化钠（NaCl）
  0.186克氯化钾（KCl）
  
  用超纯蒸馏水将体积加到50毫升用0.2μm过滤器过滤
6. 30％D-葡萄糖溶液
  15克D-葡萄糖
  
  用超纯蒸馏水将体积加到50毫升使用0.2μm过滤器进行过滤，并在4°C下保存
7. 1 N NaOH
  2克NaOH颗粒
  
  用超纯蒸馏水将体积加到50毫升注意：作为一项预防措施，使用烧杯并在此过程中保持在冰上。
8. PIPES解决方案
  1毫升1 M PIPES
  5毫升10倍氯化钠/氯化钾盐溶液
  750微升30％的葡萄糖
  1,250μl0.02％酚红
  500μl100x抗生素/抗真菌剂
  
  用超纯蒸馏水将体积加到50毫升加入75μl1N氢氧化钠将溶液从鲑鱼变成粉红色（pH值为7.4，如果变成紫红色，则重新开始）
  用0.2μm过滤器过滤
9. 激活木瓜蛋白酶解决方案
  0.00878克半胱氨酸盐酸盐
  0.0093g EDTA
  
  用超纯蒸馏水将体积加到50毫升使用0.2μm过滤器进行过滤，并在4°C下保存
10. 10毫克/毫升DNase I溶液
  10毫克脱氧核糖核酸我
  
  用超纯蒸馏水将容量调至1000μl 分装并保存在-20°C
11. 7毫克/毫升卵类粘蛋白
  7毫克ovomucoid
  
  用超纯蒸馏水将容量调至1000μl
  在-20°C分装并保持冷冻
12. 10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）
  98.9克10倍浓缩PBS PBS
  用超纯蒸馏水将体积加到1L 溶解和高压灭菌
13. 22％Percoll解决方案
  11毫升Percoll
  5毫升10x PBS
  
  用超纯蒸馏水将体积加到34毫升过滤0.2微米过滤器，并在4°C存储
14. 10％牛血清白蛋白（BSA）
  5克BSA
  用1x HBSS将体积加到50ml
  存放在冰箱里，直到完全溶解
  过滤0.2微米过滤器，并在4°C存储
15. 1％BSA / 0.1％葡萄糖/ 1x HBSS
  50毫升10％BSA
  1.67毫升30％D-葡萄糖
  448.3毫升1x HBSS
  使用0.2μm过滤器进行过滤，并在4°C下保存
16. 1x PBS
  100毫升10倍PBS
  900毫升超纯蒸馏水
17. 神经球媒体
  500μlN-2补充（100x）
  1,000微升B-27补充（50x）
  500μl200mM L-谷氨酰胺
  500μl100x抗生素 - 抗真菌剂
  500μl100x胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒（ITS-X）
  750μl1 M HEPES
  1毫升30％D-葡萄糖
  使用DMEM / F12
  将体积加到50毫升
18. 表皮生长因子（EGF）（20微克/毫升）
  1. 用足够体积的超纯蒸馏水重悬冻干产品，使终浓度为20μg/ ml
  2. 在Neurosphere培养基中稀释1：1,000以达到20 ng / ml的工作浓度
19. 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（20μg/ ml）
  1. 用足够体积的超纯蒸馏水重悬冻干产品，使终浓度为20μg/ ml。
  2. 在Neurosphere培养基中稀释1：1,000以达到20 ng / ml的工作浓度
20. 10％正常驴血清（NDS）/0.5% Triton X-100
  100μlNDS
  5μlTriton X-100
  895μl1x PBS
21. 1％正常驴血清（NDS）/0.25% Triton X-100
  10μlNDS
  2.5微升Triton X-100
  987.5μl1x PBS
22. 4％多聚甲醛（PFA）
  
  用30ml 1x PBS稀释10ml 16％PFA
致谢

这些实验过程已经在之前发表过，并在本文中由Tome-Garcia等人于2017年进行修改和修改。我们感谢西奈山伊坎医学院的病理科和生物储存库核心成员（ ISMMS），用于促进组织收集和采购，以及ISMMS流式细胞仪核心技术，以获得24小时/天的新鲜人体组织分类的专家建议和调节。这项研究得到了西奈山种子基金的支持。作者宣称没有利益冲突。

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