材料和试剂

移液器吸头（VWR，目录号：82028-570）
离心管（圆底50ml）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：3118-0050）
15毫升Falcon管（VWR，目录号：10026-076）
玻璃管（DWK Life Sciences，Kimble，目录号：885451-0022）
闪烁小瓶（Fisher Scientific，目录号：03-337-20）
涉及动物的实验：
本议定书中动物和动物组织的使用得到了佛罗里达大西洋大学机构动物护理和使用委员会的批准。公共卫生服务动物福利保证号码是A3883-01。对于所有实验，使用成年人250-300g Sprague-Dawley雄性大鼠（Harlan，IL，USA）。每笼2只动物饲养并保持在22℃，交替12小时光照/黑暗循环。允许动物至少3天的最小稳定期，之后将它们用于实验。
闪烁鸡尾酒（RPI，目录号：111175）
蔗糖（Fisher Scientific，目录号：BP220-212）
HEPES-NaOH（RPI，目录号：H2393）
Tris-HCl（Fisher Scientific，目录号：BP152-1）
氯化钙二水合物（CaCl 2•2H 2 O）（Fisher Scientific，目录号：C79-500）
磷酸二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：255793-50G）
磷酸二氢钾（KH2PO4）（Fisher Scientific，目录号：P286-1）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
氯化钠（NaCl）（VWR，目录号：BDH0286）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：EDS-100G）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100-100ML）
哺乳动物蛋白酶抑制剂（MPI）（Sigma-Aldrich，目录号：P8340）
磷酸酶抑制剂（PhI）（Halt TM）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：78426）
2-氨基乙基异硫脲 - 脲（AET）（Sigma-Aldrich，目录号：A5879）
5'磷酸吡哆醛（PLP）（Sigma-Aldrich，目录号：P9255-25G）
磷酸二钾（KH 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P8281）
丙酮酸激酶（Sigma-Aldrich，目录号：P9136-25KU）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P3911-500G）
磷酸（烯醇）丙酮酸（Sigma-Aldrich，目录号：P7127-250MG）
腺苷5'-三磷酸（ATP）（Sigma-Aldrich，目录号：A26209-10G）
硫酸镁（MgSO 4）（Fisher Scientific，目录号：M65-500）
γ-氨基 - 正丁酸（GABA）（Sigma-Aldrich，目录号：A5835）
谷氨酸（Glu）（Sigma-Aldrich，目录号：G5889-100G）
[3 H]谷氨酸（Amersham Biosciences，目录号：TRK445）
[14C] GABA（PerkinElmer，目录号：NEC290E250UC）
环氧丙烷珠（Sigma-Aldrich，目录号：O9754）
HEPES缓冲蔗糖溶液（见食谱）
克雷布斯磷酸盐（KRP）缓冲液（见食谱）
脑裂解缓冲液（见食谱）
标准的GAD缓冲区（见食谱）
GPBS缓冲区（见食谱）
ATP混合物（见食谱）

设备

移液器（VWR，目录号：89079-976）
断头台（Stoelting，目录号：51330）
扭矩均化器（Eberbach，型号：E2355，目录号：7265）
Avanti J-25离心机（Beckman Coulter，型号：Avanti J-25，目录号：363102）
Optima L-90K离心机（Beckman Coulter，型号：Optima L-90K，目录号：365672）
Tri-Carb 2900TR液体闪烁分析仪（PerkinElmer，型号：Tri-Carb 2900TR）

软件

ImageJ软件（ImageJ）
棱镜软件（GraphPad软件）
SPSS软件

程序

突触体的分离（图1）（Wu et al。，1973; Wu，1982）

图1.协议示意图
1. 添加HEPES缓冲的蔗糖溶液（4ml / g，参见配方1;使用新鲜制备的蔗糖溶液，并且在使用之前应该在冰上冷却到4℃）添加到新收集的成年大鼠脑中。丢弃小脑和脑膜。大鼠脑约4克。
  注意：除非另有说明，否则所有步骤均在冰上（4°C）进行。
2. 均匀匀化：使用力矩均化器和玻璃管，将混合物剧烈地手动均化（15次）（图1）。
3. 1000-1,500×g离心10分钟以除去核碎片（使用Avanti J-25离心机和离心管（圆底））。
4. 将得到的上清液（S1）转移到新管中，同时用等体积的蔗糖缓冲液（配方1）使团块（P1）进一步均化，并在相同的条件下重新离心以产生上清液（S1'）和沉淀P1'）。
5. 将上清液S1和S1'合并，并以20000×g离心30分钟（使用Avanti J-25离心机和离心管[圆底]）。
6. 得到的小球（P2）是粗糙的突触体部分（图1）。
7. 丢弃S2并注意丢弃的体积。通过在体积等于丢弃的上清液（S2）的新鲜蔗糖缓冲液中轻轻旋转来洗涤沉淀（P2）。
  注意：不要上下移动，只能轻轻旋动管道以重新悬浮P2。
8. 然后将溶液再次以20000×g离心30分钟以产生清洗粗突触体（P2'）。从一只大鼠脑中，大约有1毫升。使用Avanti J-25离心机和离心管（圆底）。
  如果您不立即使用P2'，请将P2'存放在-80°C;如果您继续进行下一步操作，请始终将其置于冰面上。

孤立突触体的用途
突触体制剂可用于研究高钾刺激后的神经递质释放（图1）（神经元去极化），以及分析从可以是钙依赖性或钙依赖性的突触前神经元释放神经递质的机制（Wu等人1973; Wu，1982; Bao等人，1995）。此外，突触小泡可由突触体制备，用于分析GABA摄入囊泡以及分析与囊泡膜相互作用的GAD复合物（Jin等人，2003; Wu等人。，2007; Buddhala et al。。，2012）。 GAD功能的修饰可以通过调节GAD切割和调节GAD与突触小泡的相互作用来研究（Sha等人，2005; Buddhala等人，2012 ）。下面概述了突触体的不同用途。

高K +突触体的刺激＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;
1. 将新鲜制备的洗过的粗突触体（P2'）重新悬浮在等体积的2x刺激缓冲液（新鲜制备的冷Kreb氏磷酸盐缓冲液（KRP）缓冲液，见方案2）的15ml Falcon管中。
2. 将突触体分成5个相同的部分 - 未刺激，刺激（Stim）5'，刺激10'，刺激30'和刺激60'（使用15ml Falcone管）。
3. KRP缓冲液中的突触体的等分试样通过加入10,50或100毫摩尔的KCl来刺激，并在45分钟时孵育37℃。
4. 一个未受刺激的样品作为对照（保持在4℃或在冰上）。
5. 进一步研究突触体裂解物进行免疫印迹或放射性GAD活性测定，将每个等分试样的突触体溶解在1ml脑裂解缓冲液中（见方案3）。
  6.然后将裂解物在4℃摇动30分钟，并在25,000×g下离心30分钟（使用Avanti J-25离心机）。此步骤后，收集上清液并于-80℃保存，或者为了立即制备突触囊泡，将上清液保存在冰上或4℃下。收集上清液，将蛋白质浓度标准化，作为后续步骤的样品。
神经递质的释放是依赖于钙的（Wu等，1973; Fon and Edwards，2001）
响应于增加的神经活性而从突触前神经元释放的神经递质扩散穿过突触间隙并通过附着至突触后受体来转导生理信号。
受体因此定义生理信号的性质。经典的神经递质如γ-氨基丁酸（GABA），谷氨酸盐和乙酰胆碱（ACh）激活离子通道，从而促进快速的突触传递。相比之下，神经调节剂（如单胺和多肽（以及GABA，谷氨酸和ACh））激活G蛋白偶联受体，刺激第二信使并在延长的时间范围内起作用。神经递质循环包括递质生物合成，储存，再摄取和降解。突触小泡循环包括将囊泡靶向到发生对接，融合，内吞和再循环的神经末梢。胞吐作用的高速率涉及将神经递质组装良好的SVs（囊泡神经递质转运蛋白）以及在神经末端SVs的快速再循环，无论是直接从质膜还是通过内体中间体。局部再循环包括在血浆膜上的SV对接之上从血浆膜蛋白，网格蛋白介导的内吞作用中分选SV蛋白质。通过在囊泡融合部位附近簇集的电压门控Ca 2 + +通道到达神经末端的局部升高的Ca 2+响应受调节的融合。 />
突触小泡的制备（图1）（Jin et al。，2003）
1. 突触体（P2'）在含有哺乳动物蛋白酶抑制剂（MPI）混合物和磷酸酶抑制剂（PhI）的1：100稀释度（使用圆底离心管）的10体积冰冷的纳米纯水中快速渗透。
2. 如上所述匀浆稀释的突触体裂解物并在冰上孵育45分钟。
3. 离心47000×g 15分钟（使用Optima L-90 K离心机和离心管（圆底））去除大的膜组分和线粒体。
4. 收集上清液（S3）而不干扰沉淀，并在200,000×gg下离心2小时（使用Optima L-90K离心机和离心管（圆底））。
5. 用这种方法获得的颗粒是粗糙的突触小泡（P4）。
6. 加入500μl标准GAD缓冲液（参见配方4）至每个级分以除去任何污染的稀释胞质级分（S3），并且将紧密小球（P4）洗涤三次。该颗粒将被用于以下在GABA摄取测定的细节中列出的步骤。
GABA吸收方法（Jin等，2003）
1. 如上所述纯化粗SV，并与抗GAD65IgG偶联的环氧乙烷丙烯酸珠（Sigma O9754）混合以纯化GABA能特异性SV。用4mg / ml SV（终浓度：2mg / ml），120μg/ ml丙酮酸激酶（最终浓度：60μg/ ml）在100微升总体积中孵育抗GAD65抗体-SV珠（2mg蛋白/ ml） ml的GPBS缓冲液（见方法5）]。
2. 在32°C孵育SV混合物2分钟。
3. 加入等体积的ATP混合物（SV混合物与ATP混合物的比例为1：1的比例）（2 mg / ml;见6）和移液管混合。
4. 将组合物在32℃下进一步温育，取出30μl反应混合物的等分试样，以1，5，10，15和20分钟的间隔通过硝酸纤维素膜进行真空过滤。
5. 用5ml冰冷的GPBS缓冲液洗涤膜两次
6. 膜空气干燥后，将膜置于闪烁小瓶中，加入闪烁鸡尾酒，涡旋小瓶并放置过夜。
7. 基于闪烁计数器测量值（dpm）计算持续在膜上的放射性。使用设备Tri-Carb 2900TR液体闪烁分析仪（PerkinElmer，MA，USA）测量每分钟崩解次数（dpm）
8. 对于涉及GAD抑制剂，肼或氨氧基乙酸盐的实验，首先将抑制剂与SV混合物预温育10分钟，然后加入ATP混合物。对于涉及[3 H] Glu和[14 C] GABA两者的摄取测定，条件与上述（步骤E1至E4）解释的相同，除了[在反应混合物中包括GABA和[14 H] Glu和[14 C] GABA。
与囊泡膜上的GAD复合（Jin等人，2003; Buddhala等人，2012; Modi等人，2015）
通过与SVs上的蛋白质，例如CSP，VGAT和（抗钙调蛋白依赖性蛋白酶）结合而发现的蛋白质复合物（首先是热休克同源物：HSC70）依赖性激酶II）CaMKII。这种蛋白质复合体起到一个机器的作用，可以证实GABA的生物合成和包装到SV中是完全耦合的。这说明了GABA合成，调节和包装到SV中的功能和结构耦合。
通过激活SV相关的GAD和随后将GABA包装到SV中的神经元刺激引发的生理事件可以解释如下。
GABA在动作电位发生后通过胞吐作用分配。 SV通过涉及网格蛋白涂层的工艺回收。然后通过与HSC70的相互作用将网格蛋白外壳与囊泡分开。然后将囊泡返回到SV的静息状态，其中质子梯度由V-ATP酶返回。通过质子梯度依赖性蛋白激酶通过蛋白质磷酸化刺激GAD65。蛋白激酶的候选者之一是CaMKII。然后通过GAD65新合成的GABA被VGAT载入SV。这些重新填充的含GABA的SV准备在新的动作电位发生时释放。 SGAD被钙调磷酸酶介导的去磷酸化所激活，并被蛋白激酶A介导的蛋白质磷酸化所抑制。当GABA神经元兴奋时，Ca2 +进入末端导致SGAD / GAD67（分子量为67kDa的L-谷氨酸脱羧酶）的去磷酸化和活化。在细胞溶胶中由SGAD / GAD67合成的GABA也可以转移到SV中，尽管它代表了次要途径。胞质GABA也可以被代谢以通过GABA分路途径产生ATP，其可以用于保持GABA转运的电化学质子梯度。 GAD65主要负责合成用作神经递质的GABA，而GAD67用于GABA用于其他功能，例如用作生长中的信号分子，细胞活力增加的来源和GABA来源
通过控制GAD活性来调节GABA合成（Bao等人，1995; Sha等人，2005; Wei和Wu，2005; Sha等人， 2008; Buddha等人，2012; Modi等人，2014; Chou等人，2017）
谷氨酸脱羧酶（GAD）酶GAD65和GAD67的刺激在突触前位点转换GABA神经传递。转录或mRNA剪接控制GAD65和GAD67的浓度。翻译后修饰包括蛋白水解切割，磷酸化和棕榈酰化，这些调节这些关键酶的活性（Wei等人，2004）。 GAD65（tGAD65）的截短形式比全长GAD65（fGAD65）更具动态性，但相比之下，截短的GAD67（tGAD67）比全长GAD67（fGAD67）活性低。蛋白质mu-calpain负责切割fGAD65和fGAD67。
GABA神经传递依赖于GAD是否与突触囊泡（SV）相关联，并且钙蛋白酶通过产生高活性的tGAD65来实现关键功能，所述高活性的tGAD65引起增加的GABA合成和包装摄取到SV中。
已知可逆蛋白磷酸化是负责调节蛋白功能的关键机制。神经递质系统受其合成酶的磷酸化调控也已被证实。蛋白质磷酸化和去磷酸化在调节大脑中的GAD活性中起关键作用。可溶性GAD（sGAD）在磷酸化后最有可能被蛋白激酶A（PKA）灭活，并被蛋白磷酸酶2B（PP2B，钙调磷酸酶）去磷酸化刺激。相比之下，膜结合GAD（mGAD）被磷酸化激活并被去磷酸化抑制。负责mGAD磷酸化的激酶还不知道。尽管通常认为GAD65在mGAD制剂中，并且GAD67主要存在于sGAD制剂中，但GAD65和GAD67已经显示存在于大脑制剂的可溶性和膜级分中。
PKCε调节GAD65磷酸化，而GAD67通过PKA磷酸化被抑制。 GAD67和GAD65单独的半胱氨酸残基455和446对于全长GAD调节是至关重要的。
显示T91是GAD67的关键磷酸化位点，并且hGAD65中的T95通过使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱的分析显示被激酶Cε（PKCε）磷酸化。在这些目标上与辅助因子PLP的合作控制了在PLP绑定的主动holoGAD和未绑定的主动apo GAD之间的切换。暂时切换到PLP绑定的主动holoGAD对GABA神经传递至关重要。特异于GAD65而不是GAD67的是棕榈酰化（Huntingtin相互作用蛋白）HIP14，其加速GAD65锚定到SV并增加囊泡GABA向神经传递的输入。

数据分析

用Prism或SPSS软件分析所有实验的数据。数据的统计学显着性由测试或单因素方差分析（ANOVA）确定。小于0.05的P 值被认为是显着的。数据似乎是正态分布的，在实验组之间和实验组之间观察到类似的标准偏差和标准误差。

食谱

注意：以下所有解决方案（配方1-6）都可以在4°C下保存7天。

HEPES缓冲蔗糖溶液
0.32 M蔗糖
4mM HEPES-NaOH
调节pH至7.4（10毫升/克的脑W / V）
在4°C储存
克雷布的磷酸氢钠（KRP）缓冲液
10mM Tris-HCl
2.2 mM CaCl 2 2/2 0.5mM Na 2 HPO 4 4 0.4mM KH 2 PO 4 4 4mM NaHCO 3•/ 2 80 mM NaCl
调整pH值到7.5
在4°C储存
脑裂解缓冲液
50mM Tris-HCl
150 mM NaCl
2 mM EDTA
调整pH值到8
1％Triton X-100
1％MPI＆amp; PhI
在4°C储存
标准的GAD缓冲区
50 mM磷酸钾
1 mM 2氨基乙基异硫脲溴化物（AET）
0.2mM吡哆醛5'磷酸盐
调整pH值到7.2
在4°C储存
GPBS缓冲区
9.5 mM KH 2 PO 4 4/2 40.5mM K 2 HPO 4 4 8 mM KCl
86.6毫米葡萄糖酸钾
调整pH值到7.4
在4°C储存
ATP混合物
2 mM ATP
4.4mM MgSO 4
12 mM磷酸（烯醇）丙酮酸
50μMGABA
2 mM Glu
110.1μCi/μl[3 H] Glu
在4°C储存

致谢

这项工作由佛罗里达州卫生部的Grant 6JK08和AEURA信托基金资助。
没有利益冲突或利益冲突。

参考

Bao，J.，Cheung，Y.和Wu，J.Y。（1995）。脑L-谷氨酸脱羧酶。通过去磷酸化作用抑制磷酸化和激活。“生物化学杂志”270（12）：6464-6467。
Buddhala，C.，Suarez，M.，Modi，J.，Prentice，H.，Ma，Z.，Tao，R.和Wu，J.Y。（2012）。钙蛋白酶切割脑谷氨酸脱羧酶65是病理性的并且损害GABA的神经传递。 > PLoS One 7（3）：e33002。
Chou，CC，Modi，JP，Wang，CY，Hsu，PC，Lee，YH，Huang，KF，Wang，AH，Nan，C.，Huang，X.，Prentice，H.，Wei， JY（2017）。通过苏氨酸95（T95）的磷酸化激活脑L-谷氨酸脱羧酶65同种型（GAD65）。 Mol Neurobiol 54（2）：866-873。
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Modi，J.P.，Prentice，H。和Wu，J.Y。（2014）。 GABA合成与转运的调控。新科学出版社ISBN：978-1-63321-838-3。
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Sha，D.，Jin，Y.，Wu，H.，Wei，J.，Lin，C.H.，Lee，Y.H.，Buddhala，C.，Kuchay，S.，Chishti，A.H。和Wu，J.Y。（2008）。 μ-钙蛋白酶在脑L-谷氨酸脱羧酶的蛋白水解切割中的作用 Brain Res 1207：9-18。
Sha，D.，Wei，J.，Wu，H.，Jin，Y.和Wu，J.Y。（2005）。 E.大肠杆菌中较短形式的人谷氨酸脱羧酶67的分子克隆，表达，纯化和表征大肠杆菌表达系统。大脑研究分子脑解决方案136（1-2）：255-261。
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Wu，H.，Jin，Y.，Buddhala，C.，Osterhaus，G.，Cohen，E.，Jin，H.，Wei，J.，Davis，K.，Obata，K.and Wu，JY（2007 ）。谷氨酸脱羧酶（GAD）异构体GAD65在GABA合成和转运到突触小泡中的作用 - 证据来自GAD65敲除小鼠的研究。 Brain Res 1154：80-83。
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