材料和试剂

2.0 ml反应管（SARSTEDT，目录号：72.691）
无菌牙签
铝箔
5 ml HiTrap IMAC HP色谱柱（GE Healthcare，目录号：17-0920-05）
具有10-kDa截止值的聚醚砜超滤膜（Merck，目录号：PBGC04310）
5 ml HiTrap脱盐柱（GE Healthcare，目录号：29-0486-84）
Whatman GF / F过滤器（GE Healthcare，目录号：1825-047），尺寸取决于使用的过滤设置
50 ml离心管（SARSTEDT，目录号：62.547.254）
半微量比色杯（品牌，目录号：759015）
培养皿（SARSTEDT，目录号：82.1473）
备注：另一种Pierce蛋白浓缩剂PES，10K MWCO，5-20ml（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：88527）（见注2）。
BL21（DE3）胜任 E。（新英格兰生物实验室，目录号：C2527I）
SOC-培养基（通常封装在BL21（DE3）主管大肠杆菌产品中）
FaGH17A质粒（Addgene，目录号：86462）（参见注释1）
FbGH30质粒（Addgene，目录号：86463）（参见注释1）
FbGH17A质粒（Addgene，目录号：100911）（见注1）
IPTG（来自AppliChem的异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷，目录号：A4773）
溶菌酶（来自鸡蛋清）（Sigma-Aldrich，目录号：L6876）
氯化钠（NaCl）（Carl Roth，目录号：3957.2）
胰蛋白胨（Sigma-Aldrich，目录号：95039）
酵母提取物（Sigma-Aldrich，目录号：09182）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A7002）
硫酸卡那霉素（Sigma-Aldrich，目录号：60615）
硫酸铵（（NH 4）2 SO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：A4418）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：9791）
磷酸二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：71642）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
乳糖（Sigma-Aldrich，目录号：17814）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G6279）
硫酸镁（MgSO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：208094）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：84100）
三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）（Sigma-Aldrich，目录号：RDD008）
脱氧胆酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：D6750）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
DNA酶I（来自牛胰腺）（Sigma-Aldrich，目录号：69182）
硫酸镍（II）六水合物（NiSO 4·6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：227676）
咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：I5513）
二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
3-（N-吗啉代）丙磺酸（MOPS）（Sigma-Aldrich，目录号：69947）
来自海带的海带酸（Sigma-Aldrich，目录号：L9634）
牛血清白蛋白（BSA）冻干（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）
4-羟基苯甲酰肼（Sigma-Aldrich，目录号：H9882）
HCl（37％）（Sigma-Aldrich，目录号：320331）
柠檬酸三钠二水合物（Sigma-Aldrich，目录号：W302600）
氢氧化钠（NaOH）（VWR，目录号：28244.295）
氯化钙（CaCl 2）
LB-Kana-Agar-Plates（见食谱）
LB-Kana-Medium（见食谱）
20倍NPS股票（见食谱）
50x 5052股票（见食谱）
MgSO 4储备（见食谱）
ZY-Medium（见食谱）
ZYP-5052-Rich-Autoinduction-Medium（见食谱）
蔗糖库存（见食谱）
脱氧胆酸股票（见食谱）
DNase I库存（见食谱）
NiSO <4>股票（见食谱）
IMAC缓冲区A（请参阅食谱）
IMAC缓冲区B（请参阅食谱）
SEC缓冲液（见食谱）
SEC / DTT缓冲区（请参阅食谱）
MOPS缓冲区（请参阅食谱）
BSA储备溶液（见食谱）
PAHBAH试剂A（见食谱）
PAHBAH试剂B（见食谱）
PAHBAH工作试剂（见食谱）

设备

本生燃烧器或无菌罩
2升锥形瓶（或2L普通玻璃瓶）
旋转摇瓶用于锥形瓶（推荐使用温度控制）
涡旋混合器
微量离心用于1.5或2.0ml具有冷却功能的反应管，即离心机5418R（Eppendorf，型号：5418R，目录号：5401000013）
离心机用于冷却功能为15和50毫升的离心管，即离心机5804 R（Eppendorf，型号：5804 R，目录号：5805000017）
标准膜或蠕动泵和相应的过滤装置ME1（Vacuubrand，型号：ME1）和Nalgene过滤器固定器接收器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：300-4100）
标准快速蛋白液相色谱系统（FPLC），即，ÄKTAstart（GE Healthcare，型号：ÄKTAstart，目录号：29-0220-94）
注意：另一种蠕动泵的流速≤5 ml / min。
光谱仪，也就是说，BioSpectrometer basic（Eppendorf，型号：BioSpectrometer Basic，目录号：6135000009）。
加热水浴，即，Thermolab（GFL，目录号：1070）
两个加热块，即BioShake iQ（Analytik Jena，目录号：848-1808-0506）
高压灭菌器
注意：强烈推荐高压灭菌器，但不是必需的，因为人们总是使用抗生素卡那霉素来促进细菌生长。
超滤搅拌室，即Amicon（Merck，目录号：UFSC05001）
备注：另一种Pierce蛋白浓缩剂PES，10K MWCO，5-20ml（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：88527）（见注2）。

程序

转型
1. 将每个含有一种酶的Addgene质粒转化到单独的BL21（DE3）感受态E中。根据制造商的说明并使用LB-假名琼脂平板（参见食谱）来制备大肠杆菌。常见的转化方案采用以下步骤，必须在本生灯旁边或无菌罩内进行。
2. 添加1微升含有 ca 。将100ng质粒DNA加入到细胞混合物中并小心倒转一次。不要漩涡。
3. 保持冰上5分钟，不要混合。
4. 正好在42°C的热冲击正好10秒，不混合。
5. 保持冰上5分钟，不要混合。
6. 添加500μlSOC-培养基，包含在 E中。大肠杆菌BL21（DE3）出货。
7. 在37°C孵育60分钟和500转。
8. 在LB-Kana琼脂平板上扩散100μl，37°C孵育至少15 h。
9. 在用无菌牙签挑取菌落并在37℃下在3ml LB-Kana-Medium（参见食谱）预培养中生长至少8小时并在150rpm下持续搅拌的情况下，细胞可以储存在-80在添加25％（v / v）无菌甘油（em-ie，200μl甘油在600μl预培养物中）之后加入5％
酶的过表达和纯化
1. 使用1ml来自步骤A9的预培养物在2L锥形瓶中接种1L ZYP-5052-Rich-Autoinduction-Medium（见配方）（Studier，2005）以具有足够的顶部空间。
  只需用铝箔封闭烧瓶，使气体能够进入烧瓶。
  注意：
  1. 对于所有三种酶（FbGH30，FaGH17A和FbGH17A），几乎以完全相同的方式进行过表达和纯化。但是，每种纯化都必须分开进行。将所有三种酶转化为一种表达系统并一起纯化是不可能的。尽管如此，在过表达之后，可能在一个工作日内纯化所有三种酶。
  2. 过表达也可以在IPTG诱导的LB-Kana培养基中进行。接种的培养物需要在37℃下生长8小时，然后加入1ml 1M IPTG。诱导后，培养物需要在16℃下再培养8小时。如已经描述的那样进行后续的收获和纯化。这种方法速度更快，但蛋白质含量更低。
2. 在20°C [或室温（RT）]下培养培养物约72小时，并以150 rpm的转速培养。
3. 通过在4,500℃下4,500g离心25分钟来收获细胞。弃上清。产生的颗粒可以在-20°C（多年）储存直至进一步使用。
4. 在15毫升蔗糖原液中重悬细胞沉淀（请参阅食谱）。
5. 加入5毫克的溶菌酶，并在室温下恒温磁力搅拌下以500转/分孵育10分钟。
6. 加入30ml脱氧胆酸盐原液（参见食谱）和0.2ml MgSO 4储备溶液（参见食谱）。
7. 加入1 ml DNase I储备溶液（参见食谱）以液化粘性溶液。
8. 在4℃下将溶解产物在16,000×gg下离心45分钟。将含有感兴趣蛋白质的上清转移到新管中。
9. 以下固定化金属亲和色谱（IMAC）期间的所有步骤在室温下以FPLC进行，流速为5ml /分钟。另外，该程序也可以通过蠕动泵以相同或更低的流量进行。
  注意：步骤B10-B14可以使用蠕动泵以5毫升/分钟的流速手动执行，而不是FPLC系统。然后将该柱放置在泵之后。步骤B14中的线性缓冲剂梯度可以类似地通过使用在5CV（〜5分钟）的总洗脱体积的过程中逐步增加咪唑浓度来实现。从含有50mM咪唑的IMAC缓冲液A开始，缓冲液需要每30秒更换一次。在每个步骤中，咪唑浓度增加50mM（各30秒）：50,100,150,200,250,300,350,400,450,500mM咪唑（IMAC缓冲液A和B的通常浓度为25和500mM咪唑）。为防止色谱柱上出现气泡，每当进样口从一个缓冲液切换到另一个缓冲液时，需要暂停流量。
10. 用1个柱体积（1 CV = 1 ml）的NiSO 4原液（见配方）加入5 ml HiTrap IMAC HP柱。放弃离开柱子的流量。
11. 用5 CV的IMAC缓冲液A平衡（见食谱）。放弃离开柱子的流量。
12. 将整个溶胞上清液注入柱子。如果溶液过于粘稠，则需要使用IMAC缓冲液A稀释至50 ml的体积。丢弃离开柱子的流量。
13. 用15个CV IMAC缓冲液A清洗色谱柱。丢弃离开色谱柱的流量。
14. 从IMAC缓冲液A到IMAC缓冲液B（参见食谱）以总数为5个CV的连续线性梯度洗脱蛋白质。
  收集三十毫升馏分中流出的色谱柱。
15. 仅限FbGH17A：在洗脱后立即向每个级分添加50μl还原剂DTT（0.5 mg / ml）以防止蛋白质氧化。
16. 泳池分数为6到30（如果有紫外检测器，只取对应主峰的样品）。保持蛋白质在冰上。
17. 根据制造商的说明，每次净化后都必须清洁IMAC色谱柱。
18. 与各自的10kDa膜一起组装超滤搅拌的细胞。（或者可以使用离心浓缩器，见注2）。
19. 在4°C或冰上浓缩超滤室中的蛋白质溶液至体积≤1.5 ml。
20. 在13,000×gg和4℃下离心蛋白质溶液20分钟以除去沉淀的无活性蛋白质。
21. 将上清转移到新鲜试管中并丢弃沉淀。保持蛋白质在冰上。
22. 以下使用脱盐塔除去咪唑。该程序遵循制造商的说明并且可以通过使用FPLC系统或注射器在RT和5ml / min的流速下进行。
23. 仅适用于FbGH17A：在步骤B24-26中使用SEC / DTT缓冲液（请参阅配方）而不是SEC缓冲液。
24. 用5个CV缓冲液平衡HiTrap脱盐柱。放弃离开柱子的流量。
25. 应用恰好1.5毫升的蛋白质溶液。必要时用SEC缓冲液稀释样品。不要超过1.5毫升的样本量。放弃离开柱子的流量。
26. 用2毫升SEC缓冲液洗脱并收集蛋白质，然后将蛋白质保存在冰上。
27. 根据制造商的说明，净化后的清洁柱必须经过净化。
28. 通过使用分光计测量280nm处的吸光度并且考虑每种蛋白质的分子量和消光因子（FbGH30：MW = 54,700Da，ε= 128,480M -1 cm -1）来测定蛋白质浓度， -1; FaGH17A：MW = 44,800Da，ε= 87,905M -1 -1 cm -1; FbGH17A：MW = 46,600Da，ε= 88,935 M <-1> cm -1 ）：
  
  其中，c：以mg / ml为单位的蛋白质浓度; A：在280nm处的吸光度; ε：在M -1 -1 cm -1 -1范围内的消光系数; MW：Da中的分子量; b：以cm为单位的光路长度。
  注意：可以验证过表达（步骤B1-B3），裂解（步骤B4-B8），IMAC（步骤B9-B17），浓度（步骤B18-B21）和脱盐（步骤B22-B27）的成功通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（He，2011）。
29. 将MOPS缓冲液中的蛋白质稀释（见配方）至10μM的储存浓度。保持蛋白质在冰上。
30. 仅适用于FbGH17A：在MOPS缓冲液中稀释后，必须立即使用该酶来制备等分试样（步骤B31）或进行水解反应（步骤D1-D7）。
31. 准备好即用的50μl等分试样，并在-20°C冷冻。
  注意：迄今为止，在-20°C没有关于酶的保存期限的非常长期的数据，但它们可以使用至少两年而没有任何活性降低。
采样和提取
1. 通过使用标准膜或蠕动泵以及相应的过滤设置，将环境样品，即，海水或微藻的实验室培养物过滤到0.1-0.5巴的Whatman GF / F过滤器上。所需的体积需要通过实验确定。对于海水表面，至少需要5升，对于高浓度的实验室培养，需求量要小得多（根据细胞数量，约50毫升）。必须记录每个样品的体积。生成的过滤器可以保存在-20°C直到进一步使用。
  备注：
  1. 聚碳酸酯过滤器也可以使用。过滤器的直径取决于过滤设置。
  2. 对于浓缩的实验室培养物，离心也可以用来代替过滤。硅藻培养需要在4,500 x g下离心20分钟。
  3. 该方法也可应用于大型海藻样品（L.Scheschonk等准备中）。
2. 将过滤器放入15或50毫升的离心管中。
3. 添加5-10毫升MOPS缓冲液，足以让整个过滤器都被液体覆盖。
4. 漩涡每个样本10秒。
5. 在60°C的热水浴中提取60分钟
6. 挤压并取出过滤器。
7. 在4,500 em x em下离心15分钟
8. 将上清转移到新管中。这种提取物可以在-20°C下储存数周，直至进一步使用。
  注：没有关于昆布多糖样品稳定性的长期数据。
水解
1. 每个样品分成六个子样品：三个被酶混合物水解，三个不被水解。
2. 此外，必须准备和处理（步骤C3和C5-C7）样品，以根据来自 Laminarin digitata （Sigma-Aldrich）的商业昆布多糖创建校准曲线。对于微藻样品，以下浓度是合适的：0,7.8μg/ ml，15.6μg/ ml，31.3μg/ ml，62.5μg/ ml，125μg/ ml，250μg/ ml，0.5mg / ml，1.0mg / ml和2.0mg / ml（在MOPS缓冲液中连续稀释）。
3. 解冻每一种酶原液的新鲜等分试样并保存在冰上。
4. 每种水解反应混合物包括：100μl样品提取物（或校准标准品），1μlFbGH30,1μlFaGH17A，1μlFbGH17A和1μlBSA储备溶液（见配方）（见注3）。
5. 每种非水解反应混合物包括：100μl样品提取物，1μlBSA储备溶液和3μlMOPS缓冲液（参见注释11）。
6. 通过摇动反应管混合所有样品。
7. 在37°C孵育25分钟
8. 通过在99℃在第二个加热块中温育样品5分钟停止酶反应。这种提取物可以在-20°C下储存数周，直至进一步使用。
  注：没有关于昆布多糖样品稳定性的长期数据。

还原糖测定
1. 添加1 ml PAHBAH工作试剂（见配方）（Lever，1972）至0.1 ml样品。
2. 每个样品在100°C加热5分钟注意：沸腾的持续时间直接影响吸光度，因此会影响测量的一式三份的标准偏差。人们应该尝试以与用于加热的速度完全相同的速度将样品从加热块中取出。通过这样做，可以确保每个样品在相同的持续时间内被加热。 />
3. 使用半微量比色杯和分光计测定410 nm处的吸光度。
4. 使用PAHBAH工作试剂作为空白，并稀释太浓的样品。
  注意：可以进行可靠测量的吸光度范围取决于光谱仪，必须事先在手册中进行检查。样品可以用PAHBAH工作试剂稀释。

数据分析

每个样本在六个子样本中测量。未水解的一式三份的值需要从水解样品的值中减去。

通过将该差异与校准曲线进行比较可以确定各个样品中的昆布多糖浓度。

通过精确过滤体积或细胞数量，需要将提取物中测得的浓度转换为原始样品的浓度。

根据以下校准，20 L样品中昆布多糖浓度的方程和数据如下（图2，表1）：＆nbsp;

图2.示例性校准

表1.示例性数据

笔记

所有这三种质粒都可以通过Addgene质粒库（ www.addgene.org ）由学者和非营利组织订购。。在网站上，如果Addgene只提供细菌刺，可以找到纯化质粒DNA的方案。质粒必须转化为E.E。大肠杆菌BL21（DE3）。

对于蛋白质浓度，可以选择使用基于离心的系统。这些管不可重复使用，回收率很低。但是，单次使用比超滤系统便宜。浓度必须根据制造商的说明在4°C下进行。
蛋白质溶液的体积需要减少到≤1.5毫升。

准备包含必须添加到每个样品提取物中的所有组分的主混合物是可能的和可取的。

食谱

注意：除非另有说明，Milli-Q水用于组成以下溶液。

LB-假名琼脂平板
1. 解散：
  10克NaCl
  10克胰蛋白胨
  5克酵母提取物
  12.5克琼脂
  
  使用非无菌水完成体积至1L
2. 高压灭菌器或煮解决方案
3. 让溶液冷却至50°C以下后，加入1 ml制备好的硫酸卡那霉素（50 mg / ml）。
4. 在搅拌溶液之后，需要将平板倒在本生灯旁边或无菌通风橱里
5. 当盘子是坚实的，他们可以被存放在4°C几个星期
LB-假名中等
1. 解散：
  10克NaCl
  10克胰蛋白胨
  5克酵母提取物
  
  用2升锥形瓶或瓶子中的非无菌水将体积加至1L
2. 用铝箔封闭烧瓶，但保持空气透过
3. 建议高压灭菌解决方案
4. 让溶液冷却至50°C以下后，加入1 ml制备好的硫酸卡那霉素（50 mg / ml）。
20x NPS股票解散：
66克（NH 4）2 SO 4←>
136克KH 2 PO 4 4 142克Na 2 HPO 4 4/2
使用非无菌水完成体积至1L 建议在使用前高压灭菌溶液
50x 5052股票
解散：
25克葡萄糖
100克乳糖
250克甘油（在烧杯中称量）并用非无菌水将体积加至1升
建议在使用前高压灭菌溶液
硫酸镁4股票
将12克MgSO 4溶解并用非无菌水将体积加至100毫升。
建议在使用前高压灭菌溶液
ZY-中等
将10g胰蛋白胨和5g酵母提取物溶解在928ml H 2 O中建议在使用前高压灭菌溶液
ZYP-5052-Rich-Autoinduction-Medium

混合928毫升ZY-中等 1毫升1M MgSO 4
20毫升50x 5052
50毫升20x NPS和2毫升硫酸卡那霉素（50毫克/毫升）旁边的本生燃烧器
蔗糖库存
1. 溶解250克蔗糖和6克Tris
2. 调整至pH 7.5，用未消毒的水将体积调整至1 L
3. 建议在使用前高压灭菌溶液
脱氧胆酸股票
1. 解散：
  10克脱氧胆酸钠
  10毫升Triton X-100
  5.8克NaCl
  2.4克Tris
2. 调整至pH 7.5，用未消毒的水将体积调整至1 L
3. 建议在使用前高压灭菌溶液
DNase I股票
将50 mg DNA酶I溶解在35 ml IMAC缓冲液A和15 ml甘油中
该解决方案可以存储在-20°C
NiSO <4>股票
溶解3.9 g的NiSO 4并将体积完全溶解至50 ml
注意：NiSO 4 是有害的。通过使用手套，眼睛和嘴巴保护自己。在适当的重金属废物中丢弃受污染的溶液。
IMAC缓冲区A
1. 溶解29.2克氯化钠，2.4克Tris和1.7克咪唑
2. 调整至pH 7.5，用未消毒的水将体积调整至1 L
3. 建议在使用前无菌过滤溶液
IMAC缓冲区B
1. 溶解29.2克氯化钠，2.4克Tris和34克咪唑
2. 调整至pH 7.5，用未消毒的水将体积调整至1 L
3. 建议在使用前无菌过滤溶液
SEC缓冲液
1. 溶解29.2克NaCl和2.4克Tris
2. 调整至pH 7.5，用未消毒的水将体积调整至1 L
3. 建议在使用前无菌过滤溶液
SEC / DTT缓冲区

溶解23毫克二硫苏糖醇在50毫升SEC缓冲液中
MOPS缓冲液
1. 溶解5.2克3-（N-吗啉代）丙磺酸
2. 调整到pH值7.0，并完成体积到500毫升
3. 建议在使用前无菌过滤溶液
4. 使用棕色玻璃瓶并避光。
BSA库存解决方案
将100mg BSA溶解在1ml H 2 O中建议在使用前无菌过滤溶液
PAHBAH试剂A
1. 将10g 4-羟基苯甲酰肼溶于60ml H 2 O中
2. 加入10ml浓盐酸（37％），并通过加入更多的H 2 O 2完成体积至200ml。
注意：该解决方案可以存储在室温下。如果溶液中含有沉淀物，请勿使用。
PAHBAH试剂B
1. 将24.9克柠檬酸三钠脱水物溶于500毫升H 2 O中
2. 加入2.2克CaCl 2 2并混合
3. 将40克NaOH溶解在单独的1升瓶中
4. 缓慢搅拌两种溶液并不断搅拌，用无菌水将体积加至2L。
5. 解决方案必须在几分钟内变清楚
注意：解决方案可以存储在RT处。如果溶液中含有沉淀物，请勿使用。
PAHBAH工作试剂
准备PAHBAH试剂B和PAHBAH试剂A
新鲜的9：1混合物可以使用几个小时，但需要保存在冰上

致谢

该协议是在2017年由Becker等人修改和修改的。该研究得到了德意志联邦理工学院（授予HE 7217 / 1-1给Jan-Hendrik Hehemann）和马克斯普朗克协会的支持。
作者声明，该研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，可能会被视为潜在的利益冲突。

参考

Becker，S.，Scheffel，A.，Polz，M.F。和Hehemann，J.H。（2017）。利用海洋微生物酶精确定量海洋有机物中的昆布多糖 Appl Environ Microbiol 83（9）。

Brunt，K.，Sanders，P.和Rozema，T。（1998）。淀粉工业中食物，饲料和原料中淀粉的酶法测定。淀粉 - Stärke 50（10）：413-419。 >

他，楼（2011年）。 Laemmli-SDS-PAGE 。 Bio-protocol Bio101：e80。 br />

Lever，M.（1972）。比色法测定碳水化合物的新反应。

Myklestad，S.（1974）。海洋浮游硅藻生产碳水化合物。 I.文化中九种不同物种的比较。 J Exp Mar Biol Ecol 15（3）：261-74。

Painter，T.J。（1983）。海藻多糖中：多糖。 Elsevier 195-285。

Percival，E.和Ross，A.（1951）。 156。海带多糖的构成。第二部分。海带昆布多糖的可溶性昆布多糖。 J Chem Soc（Resumed） 0：720-6。

Studier，F. W.（2005）。在高密度振荡培养中通过自动诱导产生蛋白质 Protein Expr Purif 41（1）：207-234。

Whitaker，J.R。（1974）。酶的分析应用在：Whitaker，JR（版）。 Adv Chem Ser 136：31-78。