材料和试剂

物料
1. 一次性巴斯德吸管（VWR，目录号：14672-200）
2. 3毫米玻璃珠（VWR，目录号：26396-508）
  制造商：Walter Stern，目录号：100C。
3. 带盖的100毫米玻璃管（Fisher Scientific，产品目录号：14-961-27和05-888-1A）
  制造商：Bal Supply，目录号：13144UL。
4. 带盖的150毫米玻璃管（Fisher Scientific，目录号：14-961-32和05-888C）
  制造商：Bal Supply，目录号：18144CL。
5. 0.5毫升微型管（SARSTEDT，目录号：72.699）
6. 1.5毫升微型管（SARSTEDT，目录号：72.690）
7. 无菌100 x 15毫米塑料培养皿（'盘'）（VWR，目录号：25384-302）
8. 10ml无菌BD Luer-Lok TM Tip注射器（BD，目录号：309604）
9. 0.2μm无菌PES注射器过滤器（SARSTEDT，目录号：83.1826.001）
10. 0.45μm无菌PES注射器过滤器（SARSTEDT，目录号：83.1826）
噬菌体和细菌菌株
1. 乳酸乳球菌MG1363（Félixd'Hérelle细菌病毒参考中心，目录号：HER1439）
  注意：乳酸乳球菌一般被认为是一种安全的细菌，所有的实验都可以在一级生物安全实验室进行。
2. 噬菌体p2（Félixd'Hérelle细菌病毒参考中心，目录号：HER457）
质粒
1. pL2Cas9（Lemay等人，2017）（Addgene，目录号：98841）
2. pNZ123（de Vos，1987）（乳酸乳球菌MG1363（pNZ123））（Félixd'Hérelle细菌病毒参考中心，目录号：HER1532）
酶
1. 南极磷酸酶（5,000 U / ml）（New England Biolabs，目录号：M0289S）
2. BsaI（10,000 U / ml）（New England Biolabs，目录号：R0535S）
3. 溶菌酶（20,000 U / mg干重）（Thermo Fisher Scientific，目录号：89833）
4. Q5 DNA聚合酶（2,000U / ml）（New England Biolabs，目录号：M0491S）
5. T4 DNA连接酶（1,000U / ml）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15224017）。
6. T4多核苷酸激酶（10,000U / ml）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：EK0031）
7. Taq DNA聚合酶（5,000 U / ml）（NBS Biologicals，目录号：9K-001-0034）
8. XbaI（20,000U / ml）（New England Biolabs，目录号：R0145S）
试剂
1. AccuGENE TM分子生物学水（Lonza，目录号：51200）
2. 琼脂糖LE（Roche Diagnostics，目录号：11685678001）
3. BD TM TM Bacto TM脑心浸液（BHI）（Fisher Scientific，目录号：DF0037-17-8）
  制造商：BD，目录号：237500。
4. 氯化钙二水合物（CaCl 2•2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C5080）
5. 氯霉素（Sigma-Aldrich，目录号：C0378）
6. EDTA-Na 2（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
7. 红霉素（Fisher Scientific，目录号：10583315）
8. 95％乙醇（商业醇，目录号：P016EA95）
9. 100％乙醇（商业醇，目录号：P016EAAN）
10. EZ-Vision ®三（VWR，目录号：97063-166）
11. 冰醋酸（Caledon Laboratories，目录号：1000-1-29）
12. 葡萄糖一水合物（Sigma-Aldrich，目录号：49159）
13. 甘油（Merck，目录号：GX0185-2）
14. 甘氨酸（Merck，目录号：4810-OP）
15. 颗粒琼脂（Fisher Scientific，目录号：BP1423-500）
16. 盐酸（HCl）（Fisher Scientific，目录号：351285-212）
17. 高DNA质量梯（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：10496016）
18. 1 Kb Plus DNA Ladder（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，产品目录号：10787018）
19. 低DNA质量梯（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：10068013）
20. Oxoid TM M17肉汤（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：CM0817）
21. 硫酸镁七水合物（MgSO 4•7H 2 O）（Caledon Laboratories，目录号：4860-1-70）
22. 氯化镁六水合物（MgCl 2•6H 2 O）（VWR，目录号：BDH9244）
23. 氯化钠（NaCl）（Anachemia，目录号：81708-380）
24. 引物（表1）（由Thermo Fisher Scientific定制， www.thermofisher.com ）
  
  表1.本协议中使用的引物
  
  a 下划线标出了Gibson Assembly的连接和突出的限制性位点。 'N'代表任何核苷酸，'x'代表扩增感兴趣片段所需的任何数量的核苷酸。
25. 乙酸钠（NaAc）（Sigma-Aldrich，目录号：S2889）
26. 蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S0389）
27. Tris（Base），Ultrapure（Avantor Performance Materials，目录号：4109-6）
28. 0.8％和2％琼脂糖凝胶（见食谱）
29. BHI琼脂培养基补充红霉素（见食谱）
30. BHI培养基补充红霉素（见食谱）
31. 2 M CaCl 2（见食谱）
32. 10毫克/毫升氯霉素原液（见食谱）
33. 10毫克/毫升和75毫克/毫升红霉素原液（见食谱）
34. 70％乙醇（见食谱）
35. GM17琼脂培养基补充有CaCl 2或抗生素（见食谱）
36. GM17中等（见食谱）
37. GM17软琼脂培养基补充CaCl 2（见食谱）
38. 甘氨酸休克溶液（见食谱）
39. 1 M MgCl 2（见食谱）
40. 10倍噬菌体缓冲液（见食谱）
41. 恢复解决方案（请参阅食谱）
42. 50倍TAE缓冲液（见食谱）
43. 洗液（见食谱）
套件
1. Gibson Assembly Master Mix（New England Biolabs，目录号：E2611S）
2. QIAGEN Plasmid Maxi Kit（QIAGEN，目录号：12162）
3. QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28104）

设备

高压灭菌器
台式微量离心机（Eppendorf，型号：5415 D）
本生燃烧器
离心瓶（SS-34）
离心机Sorvall RC5C和转子SS-34（Thermo Fisher Scientific，目录号：28020）
加热块干燥浴（VWR，目录号：13259-034和13259-130）
电穿孔小杯，0.2cm电极间隙（Bio-Rad Laboratories，产品目录号：1652086）
Gene Pulser II电穿孔仪（Bio-Rad Laboratories，目录号：165-2109）
孵化器摇床设置为37°C
注意：培养箱可以设置为30°C（无需摇动）和37°C。
Micropipettes（Nichiryo，产品目录号：00-NPX2-10,00-NPX2-100,00-NPX2-1000）
注意：无菌过滤枪头可减少生物气溶胶污染微量移液管。
微波炉
MultiDoc-It TM成像系统（UVP，目录号：97-0200-01）
PCR热循环仪（MJ Research，型号：PTC-200）
电源（Bio-Rad Laboratories，型号：PowerPac 300）
Spectra / Por透析膜，MWCO 6-8000（VWR，目录号：28170-138）
制造商：Spectrum，产品目录号：S632650。
分光光度计Spectronic 20D
镊子
VWR Midi Plus 15水平电泳系统（VWR，目录号：89032-296）

程序

Spacer克隆在pL2Cas9中
质粒pL2Cas9编码源自酿脓链球菌SF370的CRISPR-Cas9组分以及红霉素抗性基因。为了避免E中质粒的丢失。大肠杆菌或 L。向培养基中加入红霉素至终浓度分别为150μg/ ml（Em 150）或5μg/ ml（Em 5）。当从Addgene购买时，pL2Cas9作为转化的大肠杆菌NEB5α菌株的刺状培养物发送。步骤A2至A4由Jiang等人改编。（2013年）。
1. 纯化pL2Cas9
  1. 将刺中的细菌菌株划到BHI Em 150平板（参见食谱）。
  2. 在37°C孵育过夜。
  3. 用无菌镊子用无菌吸头挑一个菌落，将其滴入500毫升BHI Em 150中（见食谱）。
  4. 在37℃摇床培养过夜
  5. 按照QIAGEN质粒Maxi试剂盒说明书分离低拷贝质粒。
    注意：我们将异丙醇沉淀物转移到16×1.5ml的微管中，以减少洗涤过程中DNA的损失。然后将每个DNA沉淀重新溶解于20μl提供的质粒再悬浮缓冲液中，并收集在1.5ml微量管中。
  6. 在0.8％琼脂糖凝胶（见食谱）上用高DNA质量梯（Ladder）运行纯化的质粒DNA制备样品，以估计DNA浓度。
    注意：为了使DNA可视化，我们使用EZ-Vision三个6x上样缓冲液，其中含有荧光DNA染料。 em>
  7. 将纯化的质粒DNA保存在-20°C直到需要。
2. 垫片设计和退火
  1. 在基因座中搜索5'-NGG-3'序列进行修饰（图1）。这个特征序列构成了SpCas9识别的protospacer毗邻基序（PAM）。
  2. 为了在pL2Cas9中克隆所需的间隔物，设计并合成对应于具有BsaI限制性位点的所选原始空间的两条链的35个核苷酸的两个ssDNA寡核苷酸（图1，表1）。
    注意：间隔序列的GC含量不应该影响SpCas9切割其靶DNA的效率（Tao et al。，2017）。为了避免脱靶活动，确保在功能性PAM旁边的噬菌体或克隆宿主基因组的其他位置没有发现原型间隔区。
  3. 将分子生物学水中的寡核苷酸稀释至50μM。
  4. 为了寡核苷酸的5'-磷酸化，在PCR管中将2μl各稀释的寡核苷酸与10μl5x T4连接酶缓冲液，1μlT4多核苷酸激酶（PNK）和32μl蒸馏水混合至最终体积为50 μl。
    注：5×T4连接酶缓冲液提供T4 DNA连接酶。将连接酶缓冲液分成一次性等分试样，因为缓冲液中的ATP可以通过反复冻融循环而降解。
  5. 在37°C下进行磷酸化30分钟，然后在65°C（在PCR仪器或水浴中）加热使PNK失活20分钟。
  6. 添加2.5微升的1M氯化钠的磷酸化寡核苷酸。
  7. 将管置于PCR热循环仪中，在95°C下加热样品5分钟，然后以0.1°C /秒的速率冷却至25°C。
  8. 保持在-20°C最长2个月。
    
    图1.隔垫设计的图形表示。在这个例子中，在噬菌体基因组中鉴定出PAM。 PAM上游的30bp序列称为“原型间隔区”，并且必须以“间隔区”的形式并入CRISPR阵列（crRNA）以指定目标特异性。将BsaI限制性位点添加到间隔物的末端用于连接到pL2Cas9中。
3. 用BsaI消化pL2Cas9
  1. 按照制造商的说明，在37℃孵育过夜（最终体积为50μl），用BsaI消化1μg纯化的pL2Cas9。
  2. 按照生产商的说明，用南极磷酸酶去磷酸化消化的pL2Cas9的5'端。
  3. 通过用盐和乙醇沉淀纯化消化的和去磷酸化的载体。
    注意：通过凝胶提取纯化除去未切割的载体，但收率差。
  4. 在0.8％的琼脂糖凝胶上使用退火的寡核苷酸，以及高DNA质量和1 Kb Plus DNA Ladders在分开的孔中运行纯化的载体，以估计浓度。
  5. 将消化的pL2Cas9保存在-20°C直到需要。
    注意：分装成较小的体积以防止在反复冻融循环过程中可能发生的DNA降解。
4. 靶向质粒的连接
  1. 按照生产商的说明，用T4 DNA连接酶建立连接反应。
    使用插入物与载体的摩尔比约为3：1
  2. 准备另一个连接反应没有插入（阴性连接控制）来评估载体重新环化。
  3. 在16°C（在PCR仪器或水浴）中过夜
  4. 在65°C加热灭活连接酶10分钟，置于冰上，立即进行转化（步骤A5和A6）。
    注意：连接产品可以在-20°C保存几天，但转化效率会降低。
5. 准备 L。 lactis MG1363感受态细胞
  注意：如果与其他噬菌体宿主一起工作，DNA构建体的转化可以直接进入感兴趣的细菌宿主，或者首先进入乳酸乳球菌MG1363。在后一种情况下，DNA构建体必须从克隆宿主中提取，然后转移到感兴趣的宿主中。应该用一个质粒转化细胞，用合适的抗生素选择，制成感受态，用第二个质粒转化，并用两种抗生素选择。我们不建议进行双重转换。
  1. 用乳酸乳球菌MG1363接种10毫升GM17肉汤（见食谱），并在30℃孵育过夜。
  2. 用300μl来自步骤A5a的过夜培养物接种含有9.7ml甘氨酸休克溶液（参见食谱）的5个管。注：10毫升的细菌培养物足以制备50微升的感受态细胞。（1）连接产物，（2）未切割载体（阳性转化对照），（3）去磷酸化切割载体（阴性消化对照），（4）阴性连接对照，（5）没有DNA（阴性转化对照）。如果需要，可以同时准备更多的培养物。
  3. 在30°C孵育，直到细菌培养物达到0.2的OD 600。
  4. 将培养物转移到无菌离心瓶（SS-34）中，并在4℃和12,000×g g离心5分钟。
    注意：从此之后，文化和解决方案应尽可能地保存在冰上。
  5. 丢弃上清，并重悬在1毫升无菌冷洗液（见食谱）每个颗粒。
  6. 将细胞转移到1.5毫升的微管中。
  7. 在台式微量离心机中以16,000×g g离心1分钟使再悬浮液离心。
    注意：我们在室温下（RT）执行这一步骤，但可以使用冷冻微量离心机来保持培养物冷（〜4°C）。
  8. 重复最后三个步骤两次。
  9. 将每一粒感受态细胞重悬于50μl无菌冷洗液中，然后将其置于1.5ml微量管中，立即进入步骤A6。
6. 电击 L。乳糖 MG1363
  1. 透析器使用膜组装DNA（图2）。
    注意：Ligation和Gibson组装产品应在电穿孔之前进行脱盐。
    
    图2.快速简单的DNA透析A.用本生灯火焰加热巴斯德移液管的宽端，直到玻璃变红。 B.迅速刺穿1.5毫升微管的盖子。 C.在微管中加入2ml蒸馏水。由于表面张力，凸形弯月面应位于微管边缘的上方。 D.将4厘米见方的透析膜（MWCO 6-8000）置于蒸馏水中。一旦水合，将透析膜管切成一定长度以具有两个单独的膜层。把单层膜放在水上，关闭微管的盖子。确保水和圆顶膜之间没有气泡。 E.除去膜上多余的水分。 F.将5μl的DNA样品放在膜上。 G.等待约30秒。 H.收集脱盐的DNA。对每个样品重复整个过程进行透析。
  2. 加入5μlDNA（或用于阴性转化控制的水）和45μl感受态细胞到冷电击杯中。
    注意：将比色杯和回收溶液放在冰上。
  3. 将基因脉冲发生器设置为25μF，200Ω和2.5 KV。
  4. 将一个比色皿放在轨道上，同时按下两个红色按钮，直到声音。
  5. 向细胞中迅速加入500μl冷回收溶液（参见食谱），并在冰上放置10分钟。
  6. 将比色杯的内容转移到1.5毫升的微管中。
  7. 重复最后三步
  8. 在30°C孵育2小时
  9. 在补充有适当抗生素的GM17上铺板细胞（见食谱）。
    每个平板使用5-10个玻璃珠将转化的细胞均匀分散
  10. 在30°C孵育24-48小时
7. 菌落PCR
  1. 为了确认质粒构建物中DNA插入物的存在，用无菌吸头挑出几个单菌落，并将它们放入50μl分子生物学水中。
    注：筛选的菌落数取决于消化的载体对照板上的背景菌落数。
  2. 使用相同的移液器吸头，将菌落划线在补充有适当抗生素的GM17平板上，并在30℃孵育过夜。
    注意：此板块稍后将启动阳性克隆的液体培养。
  3. 每50μlPCR反应用Taq DNA聚合酶使用5μl的DNA模板（水细菌悬浮液）。始终遵守制造商的说明。
    注意：我们使用骨架特异性引物Cas9_S.pyo_F6和crRNA_S.pyo_R（表1）来筛选pL2Cas9的CRISPR阵列中的新的间隔区。未切割的载体或所需的连接产物的扩增都将产生815bp的片段。为了筛选正确修复模板的克隆，我们使用骨架特异性引物pNZins_F和pNZins_R（表1）。未切割的pNZ123的扩增将产生145bp的片段，而组装的修复模板将产生更大的可变长度的片段。
  4. 使用1 Kb Plus DNA Ladder，在2％琼脂糖凝胶（参见食谱）上运行PCR产物，以确定它们的大小。
  5. 为了确认插入序列，提交PCR产物用于Sanger测序。
    注：为减少PCR产物的测序数量，也可用插入特异性引物鉴定阳性克隆。为了在pL2Cas9中筛选新的间隔区，我们使用来自步骤A2（表1）和crRNA_S.pyo_R的寡核苷酸I.当一个阳性克隆导致扩增一个391bp片段时，一个阴性克隆没有产物。
  6. 接种10毫升的GM17肉汤培养基，补充适当的抗生素与阳性克隆，并在30°C孵育过夜。
  7. 在-80°C储存细胞，加入850μl过夜培养物到150μl无菌甘油。
同源修复模板的构建
我们使用广泛的主机范围和高拷贝数质粒pNZ123构建我们的重组模板。它赋予氯霉素抗性的细菌细胞携带它。为了避免质量损失。以最终浓度5μg/ ml（Cm 5）提供氯霉素。可以使用其他与pL2Cas9相容的质粒。最重要的是，修复模板必须设计为缺乏Cas9靶序列，以便重组噬菌体和模板本身可以避免切割。最有效的方法是创建删除整个目标序列（PAM和protospacer）的删除（图3）。否则，可以在PAM中引入单个突变和/或在原型间隔中的多个突变以防止DNA切割。如果目标序列位于编码区域，则应根据密码子使用模式设计突变。

插入A（左侧）含有感兴趣基因的5'末端（黄色），插入B（右侧）含有3'末端同一个基因的末端。从噬菌体基因组扩增的两个片段是修复模板的同源臂。使用吉布森组装（pNZ_insertA和pNZ_insertB，表1），外部引物具有重叠（绿色）以将扩增子插入到线性化的pNZ123中。内部引物具有互补的突出端（黄色）用于一起退火。两个插入物的组装去除部分黄色基因，并且修复模板中没有靶序列（蓝色框）。类似的策略可以用来产生缺失，点突变和插入。
1. 纯化pNZ123
  1. Streak L。乳酸MG1363（pNZ123）转化为GM17Cm5板（参见食谱）。
  2. 在30°C孵育过夜。
  3. 用无菌镊子用无菌吸头挑一个菌落，将其尖端放入500ml GM17 Cm 5中（见食谱）。
  4. 在30°C静夜培养
  5. 在6,000×g×15分钟的条件下离心收获过夜培养物
  6. 在20毫升缓冲液P1（从QIAGEN质粒Maxi试剂盒）补充溶菌酶30毫克/毫升的重悬细菌颗粒。
  7. 在37°C孵育30分钟
  8. 遵循QIAGEN质粒Maxi试剂盒方案。
  9. 在0.8％琼脂糖凝胶（见食谱）上用高DNA质量梯（Ladder）运行纯化的质粒DNA制备样品，以估计DNA浓度。
  10. 将纯化的质粒DNA保存在-20°C直到需要。
2. pNZ123的线性化
  1. 按照制造商的说明，用XbaI消化1μg纯化的pNZ123并在37℃过夜温育。
  2. 用引物pNZ_XbaI_F和pNZ_XbaI_R（表1）和Q5 DNA聚合酶按照生产商的说明扩增消化的载体。我们使用58℃的退火温度和75秒的延伸时间。
    注意：消化的载体的扩增显着减少了未切割或重新环化的载体的背景。
  3. 用QIAquick PCR纯化试剂盒按照生产商的说明清洁产生的PCR产物。在分子生物学水中洗脱。
  4. 将线性化和PCR扩增的pNZ123保存在-20°C直到需要。
    注意：分装成较小的体积以防止在反复冻融循环过程中可能发生的DNA降解。
3. 插入物的扩增（图3）
  1. 将具有适合吉布森组装的重叠的引物设计成线性化的pNZ123。
    注意：即使制造商推荐在要装配的片段之间有20bp的重叠，我们发现＆gt; 30 bp的重叠显着提高了装配效率。尽管250-500bp的同源臂是优选的，但较短的臂通常足以与噬菌体基因组重新组合。
  2. PCR使用噬菌体基因组作为模板并按照生产商的说明用Q5 DNA聚合酶扩增插入物。
  3. 在线性化的pNZ123上进行2％琼脂糖凝胶电泳，分别在不同的孔中加入Low DNA Mass和1 Kb Plus Ladders，以确定和确定片段的浓度。
4. 装配和转换修复模板
  1. 根据制造商的说明，使用Gibson Assembly Master Mix组装步骤B1和B2中的片段。
    注意：为获得最佳效果，请在同一天组装并转换修复模板。
  2. 在50°C孵育1小时
  3. 保持冰（或-20°C），直到需要。
  4. 准备 L的感受态细胞。乳酸MG1363（步骤A5）。
    注：还可以将修复模板电穿孔到已经含有靶向质粒pL2Cas9的乳酸乳球菌MG1363中。
  5. 立即进行修复模板的电穿孔（步骤A6），并在补充适当抗生素的GM17上铺板细胞。
  6. 在30°C孵育24-48小时注意：用两种抗生素进行选择通常会减慢细菌的生长。
  7. 通过菌落PCR分析转化体（步骤A7）。
噬菌体工程（图4）
我们进行双层噬斑试验以获得分离的噬菌斑并纯化重组噬菌体。如果细菌宿主含有步骤A和B中获得的两种DNA构建体，则该步骤可容易地适用于其他噬菌体 - 宿主对。我们在噬菌体感染期间不使用抗生素选择，因为质粒在λ中是稳定的。乳糖 MG1363。
不同宿主的质粒稳定性可能有所不同，在某些情况下应考虑抗生素的选择

图4.使用CRISPR-Cas9靶向基因组编辑噬菌体p2。噬菌体p2感染L。含有靶向质粒（pL2Cas9）的MG1363和修复模板。 CRISPR阵列被描绘成黑色菱形（重复）和蓝色框（间隔）。病毒DNA进入细菌后不久，CRISPR-Cas9复合物识别并裂解其靶标。然后可以用适于同源重组并且具有期望的突变（这里是缺失）的模板修复基因组损伤。
重组噬菌体避免CRISPR-Cas9系统切割，因为它们缺少靶序列
1. 噬菌体感染
  1. 用含有靶向质粒和修复模板的乳酸乳球菌MG1363接种10ml的补充有Em5和Cm5的GM17。
  2. 在30°C孵育过夜
  3. 进行噬菌体p2裂解物的十倍连续稀释。准备六个无菌1.5毫升微管含有900微升1x无菌噬菌体缓冲液（见食谱）。添加100微升未稀释的噬菌体裂解物到第一个微管和上下轻轻吹打混合。这是稀释10 -1 -1。使用新的移液管吸头，将100μl10-1稀释液转移至第二个微量管（稀释度10 -2 -2），轻轻混匀，重复至稀释10 -6 。
  4. 添加300μL的过夜细菌培养到补充有CaCl 2（参见食谱）的3ml GM17软琼脂培养基中，保持在50℃。
  5. 加入100μl未稀释的噬菌体裂解液。
  6. 快速倒入补充有CaCl 2的GM17琼脂培养基的顶部，并且将板旋转以均匀地铺展软琼脂。
  7. 重复最后三个步骤进行稀释10 - 2 - ， - 10 - 4和10 - 6 - 。
  8. 在30°C孵育24小时
  9. 用截短的无菌吸头挑取3个噬菌斑，并将每个含有噬菌体的琼脂塞放入含有500μl1x噬菌体缓冲液的单独的无菌1.5ml微管中。
    注意：噬菌斑可以保存在4℃的缓冲液中数周。
  10. 让噬菌体在缓冲液中扩散>在室温20分钟。
  11. 在相同的细菌菌株上重复两轮感染（步骤C1a至C1j）以纯化重组噬菌体。
2. 突变噬菌体分析
  1. 设计扩增噬菌体基因组的突变区域和缺失修复模板的引物对。
  2. 使用Taq DNA聚合酶每50μlPCR反应5μL噬菌体悬浮液，并按照制造商的说明。使用野生型噬菌体p2作为阳性对照的模板。
  3. 使用1 Kb Plus DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶上运行PCR产物，以确定它们的大小。
    注意：与用野生型噬菌体p2获得的那些相比，用重组噬菌体获得的较短的PCR产物可在凝胶上观察到基因缺失。
  4. 提交用于Sanger测序的PCR产物，并将它们与噬菌体基因组进行比对以确认重组噬菌体中所需的突变。
    注意：在实验室条件下敲除对于噬菌体增殖不重要的基因总是会导致重组噬菌体的同质群体。
  5. 测序工程噬菌体的全基因组，以确认没有额外的突变。
    注：迄今为止，我们测序了几个突变噬菌体的全基因组，并且在CRISPR-Cas9介导的基因组工程之后没有检测到脱靶突变。
    
    如果需要遗传补偿来抵御有害的突变，可能会出现意想不到的突变。

数据分析

用这种方法生成噬菌体p2的多个突变体。我们引用读者的原始文件（Lemay 等，2017年）。

笔记

为了节省时间，协议中的一些步骤可以同时完成（图5）。

图5.说明使用CRISPR-Cas9生成突变噬菌体的方案的流程图
基因缺失不适合体内研究噬菌体增殖所必需的基因。当敲除不可能时，可以产生非破坏性突变，如点突变或插入。

食谱

0.8％和2％琼脂糖凝胶
1. 加入0.8克或2克琼脂糖LE到100毫升的1x TAE
2. 加热到微波融化
3. 冷却到〜50°C
4. 将合适的体积倒入电泳装置中并添加所需的梳子。让琼脂糖固化，删除梳子，并用1倍TAE缓冲液覆盖凝胶
BHI琼脂培养基补充红霉素
注意：重要的是使用BHI，因为大肠杆菌对溶原培养液（LB）中的红霉素更具抗性。
1. 将3.7克BHI和1克琼脂溶于75毫升蒸馏水中
2. 用蒸馏水完成100毫升
3. 高压灭菌消毒并冷却至50°C
4. 加入200微升75毫克/毫升红霉素（150微克/毫升）
5. 每盘倒入约20毫升的培养基
6. 在4°C的黑暗中保存
BHI培养基补充红霉素
1. 将18.5克BHI溶于500毫升蒸馏水中
2. 通过高压灭菌和冷却来消毒
3. 在室温（RT）
  存放
4. 准备好培养细菌时，加入1毫升75毫克/毫升的红霉素（150微克/毫升）
2 M CaCl 2 2
注意：噬菌体p2感染需要CaCl 2 。
1. 将29.4克CaCl 2•2H 2 O溶于100毫升蒸馏水中
2. 通过高压灭菌和冷却来消毒
3. 少量分装以限制溶液污染
4. 在RT
  存储
10毫克/毫升氯霉素原液
注：氯霉素是选择含有pNZ123和衍生物的细菌所必需的。
1. 将0.1克氯霉素溶于10毫升95％乙醇中
2. 在-20°C储存
10毫克/毫升和75毫克/毫升红霉素原液
注：红霉素是选择含有pL2Cas9及其衍生物的细菌所必需的。
1. 将0.1克或0.75克红霉素溶于10毫升95％乙醇中
2. 在-20°C储存
70％乙醇
1. 将2.8升100％乙醇与1.2升蒸馏水混合
2. 在RT
  存储
GM17琼脂培养基中补充有CaCl 2或抗生素
1. 溶解37.25克M17,5克葡萄糖一水合物和10克琼脂在850毫升蒸馏水中
2. 完成1升蒸馏水
3. 高压灭菌消毒并冷却至50°C
4. 加入5ml无菌2M CaCl 2（终浓度10mM）或0.5ml适当的10mg / ml抗生素原液（最终浓度为5μg/ ml）。
5. 每盘倒入约20毫升的培养基
6. 如果补充了抗生素，应在室温或4°C避光保存
GM17中等
1. 将37.25克M17和5克葡萄糖一水合物溶于1升蒸馏水中
2. 通过高压灭菌和冷却来消毒
3. 在RT
  存储
GM17软琼脂培养基补充CaCl 2 2
1. 将3.73克M17，0.5克葡萄糖一水合物和0.75克琼脂溶于85毫升蒸馏水中
2. 用蒸馏水完成100毫升
3. 高压灭菌消毒并冷却至50°C
4. 加入0.5ml无菌2M CaCl 2（终浓度10mM）
5. 根据需要将3毫升培养基倒入多达13 x 100毫米的无菌玻璃管中
6. 保持在50°C在加热块干燥浴等分直到准备使用
7. 将剩余的介质存放在室温下，并在需要时融化在微波炉中
甘氨酸休克溶液
1. 在GM17肉汤培养基中溶解1克甘氨酸和17.1克蔗糖，最终体积为100毫升。
2. 过滤通过0.2微米无菌PES注射器过滤器消毒
3. 将解决方案存储在RT
1M MgCl 2 2
1. 将203.3克MgCl 2•6H 2 O溶于1升蒸馏水中
2. 通过高压灭菌来消毒
3. 在RT
  存储
10倍噬菌体缓冲液
1. 将58克NaCl和20克MgSO 4•7H 2 O溶于500毫升1M Tris-HCl pH7.5中
2. 完成1升蒸馏水
3. 通过高压灭菌来消毒
4. 在RT
  存储
5. 对于1x噬菌体缓冲液，用900ml蒸馏水稀释100ml 10x噬菌体缓冲液，通过高压灭菌将其灭菌，并分装成小份以防止污染。
恢复解决方案
1. 对于100ml的最终体积，将17.1g蔗糖溶解在补充有2ml 1M MgCl 2和100μl2M CaCl 2 2的GM17肉汤培养基中/>
2. 过滤通过一个0.2微米无菌PES注射器过滤器消毒
3. 将溶液储存在4°C
50倍TAE缓冲液
1. 混合242克Tris碱，57.1毫升冰醋酸，100毫升0.5M EDTA pH8.0
2. 完成1升蒸馏水
3. 在RT
  存储
4. 对于1x TAE缓冲液，用980 ml蒸馏水稀释20 ml TAE 50x
洗涤溶液
1. 在800毫升蒸馏水中混合100毫升甘油和171克蔗糖（0.5M）
2. 完成1升蒸馏水
3. 通过高压灭菌来消毒
4. 将溶液储存在4°C

致谢

该协议详细介绍了原始论文中使用的方法（Lemay等人，2017）。我们感谢Witold Kot和Hanne Hendrix的深入讨论。 M.-L.L.由加拿大自然科学和工程研究委员会（NSERC）的一个奖学金支持。 S.M.承认NSERC发现计划的资助。 S.M.在Bacteriophages拥有一级加拿大研究主席。作者声明没有竞争的经济利益。

参考

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