材料和试剂

移液器提示
1.7 ml微量离心管（DOT Scientific，目录号：609-GMT）
TPP 15 ml锥形离心管（TPP Techno Plastic Products，目录号：91015）
10厘米组织培养皿
96孔组织培养板（Corning，Costar ，目录号：3596）
96孔黑底检测板（Corning，目录号：3915）
0.2μm注射器过滤器（Corning，目录号：431219）
Nalgene TM0.45μm醋酸纤维素注射器过滤器（Thermo Fisher Scientific，目录号：190-2545）
聚碳酸酯离心管（32ml，Beckman Coulter，目录号：355631）
BON细胞（德克萨斯州加尔维斯顿德克萨斯医科大学C.M. Townsend，德克萨斯州Galveston的礼物）
注意：将DMEM / F12（1：1; Thermo Fisher Scientific，Gibco TM）的BON细胞维持在目录号：11965092和补充有10％FBS（PHENIX Research Products，目录号：FBS-500US）的5％CO 2和11765062）在37℃和5％CO 2下进行。
HEK293FT细胞（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：R70007）
DMEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11965092）
F12营养素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11765062）
胎牛血清（PHENIX Research Products，目录号：FBS-500US; Thermo Fisher Scientific，目录号：16000044）
Metafectamine SI（Biontex Laboratories，目录号：T100-1.0）
RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific，目录号：13778030）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P3911）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P0662）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：792519）
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S9763）
磷酸氢二钠七水合物（Na 2 HPO 4•7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：S9390）
胰蛋白酶-EDTA 0.25％（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25200056）
NPY-Venus lenti构建pTM14-NPY-Venus（马丁实验室的请求）
Opti-MEM培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：31985070）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：793639）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M9272）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：DX0145）
离子霉素（Sigma-Aldrich，目录号：I0634-5MG）
DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：D8418-50ML）
Hybri-Max TM，细胞培养级DMSO（例如，Sigma-Aldrich，目录号：D2650）。
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T9284-1L）
3-H-血清素（PerkinElmer，目录号：NET498001MC）
L-抗坏血酸（Sigma-Aldrich，目录号：A5960-25G）
包裹质粒pMD2.G（Addgene，目录号：12259）
包装质粒psPAX2（Addgene，目录号：12260）
硫酸鱼精蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：P4020）
BON细胞培养基（见食谱）
HANK的缓冲区（见食谱）
PSS钠（见食谱）
L-抗坏血酸溶液（见食谱）
HEK细胞培养基（见食谱）
病毒生产介质（见食谱）
HBeS（2x）（见食谱）
CaCl 2溶液（见食谱）
鱼精蛋白硫酸盐（见食谱）
BON细胞冷冻培养基（见食谱）

设备

组织培养孵化器
多道移液器
自动化液体处理系统（Biotek Microflo分液器，Thermo Scientific Matrix Hydra DT 96孔液体处理器，可选）
（Tecan Trading，型号：Infinite F500）的Tecan平板读数器（具有激励滤波器485/20和发射滤波器535/25的Infinite F500或具有激励505/20和发射535/10的Safire II） br />
Beckman用Ti70转子超速离心机
Ti70转子（Beckman Coulter，型号：70 Ti）
多通道抽风机（Argos Technologies，目录号：EV503）
FACS分选机（BD，型号：FACSAria TM II）
荧光显微镜与FITC激发和发射过滤器
闪烁体计数器

程序

BON电池的维护
BON细胞是源自转移的人胰腺肿瘤的神经内分泌肿瘤细胞（Parekh等人，1994）。它们含有许多DCV并在刺激条件下分泌5-羟色胺，神经降压素和胰抑制素（Parekh等人，1994）。由于它们相对较大的DCV和快速生长，BON细胞是研究DCV胞吐作用的良好模型（Karatekin等人，2008; Samuel Tran等人，2004）。
1. BON细胞在含有10ml培养基的10cm组织培养皿中于37℃在5％CO 2培养箱中培养（参见食谱）。
2. BON细胞通常每三天以1：5或1：6的比率分裂。从合流的10厘米的碟子中分离细胞：
  1. 用5 ml HANK's（含1 mM EDTA）缓冲液清洗BON细胞（见食谱）。
  2. 加入1毫升0.25％胰蛋白酶-EDTA并在37℃孵育3分钟以分离细胞。
  3. 加入5ml正常培养基，并与细胞充分混合以终止胰蛋白酶消化，将细胞悬浮液转移至15ml锥形离心管中，并通过低速离心（1000xg，5分钟）使细胞沉淀。
  4. 用5或6毫升正常培养基重悬细胞，并加入1毫升，每9厘米培养基内10厘米的菜。
3. 对于siRNA转染，我们推荐在细胞分裂后48小时使用BON细胞，当细胞健康并在对数期增长。
NPY-金星分泌分析
NPY-金星分泌测定法使用稳定表达NPY-金星的BON细胞，其可以从Martin Lab获得，或者按照程序D“建立NPY-表达Venus的细胞系”中所述的步骤产生。本节所有内容都是针对96孔板的一个孔。
1. siRNA转染
  1. 在含有Metafectamine SI或RNAiMAX的96孔板中混合siRNA和转染试剂。对于每种siRNA处理，我们推荐8次重复，其中4次用于测定Ca2 +刺激的分泌，另外4次用于背景分泌（图1A）。
  2. 在正常生长培养基中制备浓度为1.8×10 5个细胞/ ml的BON细胞悬液（见程序A）。
  3. 孵育步骤完成后，将100μl细胞悬液加入到siRNA混合物中。将平板置于室温下10分钟，然后转移至37℃和5％CO 2的组织培养箱中。
  4. 在进行分泌测定前，将细胞孵育48小时
2. 准备缓冲区
  1. 预热PSS钠（见食谱）至37°C。
  2. 通过将Ionomycin（溶解于DMSO，5mM原液）以1.25μM的最终浓度添加至PSS-Na来制备刺激缓冲液。设计用于刺激的每个孔需要〜100μl刺激缓冲液。
  3. 通过向PSS中加入DMSO制备对照缓冲液，并确保DMSO浓度（如果离子霉素储备溶液为5mM，则1 / 4,000稀释）与刺激缓冲液中的相同。设计为对照的每个孔需要〜100μl控制缓冲液。
  4. 通过向PSS中加入Triton X-100制备最终浓度为1％的裂解缓冲液。每孔需要〜100μl裂解缓冲液。
3. 刺激细胞分泌（图1B）
  1. 用多通道吸气器去除培养基。
  2. 用200μl预热的PSS-Na洗涤细胞一次并除去洗涤缓冲液。
  3. 向细胞中加入100μl刺激缓冲液或对照缓冲液。 37°C孵育10分钟。
  4. 将95μl上清液转移至96孔测定板中。避免破坏细胞。添加普通缓冲区（刺激和控制缓冲区）到3个空井进行背景标准化。保持在黑暗的板块。
  5. 向细胞中加入95μl裂解缓冲液，并在37℃孵育10分钟。
  6. 用移液管将细胞与溶解缓冲液混合，然后将95μl转移至96孔测定板。将裂解缓冲液加到3个空的孔中进行背景标准化。
    
    图1. NPY-金星分泌测定的图解总结。：一种。用于测试两种感兴趣的siRNA的示例实验的板设计。已知抑制NPY-维纳斯分泌的阳性对照siRNA（例如，CADPS siRNA）和已知不影响NPY-维纳斯分泌的阴性对照siRNA（例如，Dharmacon非靶向siRNA D-001210-03-20）应始终包含在每个实验中。每个siRNA使用8个孔，4孔用离子霉素/ Ca 2+刺激，另外4个用于背景分泌。将6个孔保留为空白，以使黑色测定板上的相同孔（见B）可用于测定纯缓冲液的背景荧光。对照siRNA：阳性对照siRNA; neg对照siRNA：阴性对照siRNA。 B. NPY-金星分泌测定的步骤。从左到右：用siRNAs进行逆转染;培养两天后，取出培养基并用预热的PSS-Na洗涤细胞;用含有离子霉素或DMSO的PSS-Na刺激细胞，然后将上清液转移到黑色测定板上;用1％Triton X-100溶解细胞，然后转移到黑色测定板;添加普通缓冲液保留井（见A），然后用平板读数仪确定NPY-金星荧光。详情请参阅文本。
4. 测量NPY-维纳斯
  通过Tecan平板读数仪测定上清液和裂解液中的NPY-金星荧光。我们推荐使用单色平板阅读器（激发505/20纳米，发射535/10纳米），但我们也成功地使用GFP / FITC（激发485/20纳米，发射535/25纳米）的滤波器组。
  在自动化液体处理系统的帮助下，NPY-Venus分泌分析可适应高通量筛选。
  1. 对于siRNA转染，使用多通道移液器或自动液体处理系统将1.2μlsiRNA从siRNA文库传送到96孔板。
  2. 对于siRNA转染，通过自动液体处理系统（Biotek Microflo分配器）将100μl细胞悬液递送至siRNA混合物。
  3. 对于NPY-Venus分泌，使用自动液体处理系统（Thermo Scientific Matrix Hydra DT 96孔液体处理器）进行所有液体处理步骤。
3 H-血清素分泌试验
血清素分泌测定使用亲本BON细胞。 NPY-维纳斯细胞系也应该起作用，尽管我们还没有对它进行测试。请注意，血清素分泌检测涉及放射性，因此必须根据放射性实验室的当地法规进行实验，并且废物必须妥善处置。本节所有内容都是针对96孔板的一个孔。
1. siRNA转染。
  按照步骤B1中所述的步骤进行操作（参见注2）。
2. 在siRNA转染后24小时加入具有3 H-血清素的细胞，通过向每个孔中加入下列混合物（不替代培养基）。
  3H-血清素（1mCi / ml）：0.2μl
  L-抗坏血酸（150mM）（见食谱）：0.33μl
  H 2 O：1.47μl
  总计：2微升
3. 用3 H-血清素孵育18小时后测定血清素分泌量。
  按照步骤B3中所述的相同步骤进行操作，除了：
  对于步骤B3d：不是将上清液转移至测定板，而是将其收集到1.7ml微量离心管中并离心以除去完整的细胞和细胞碎片。
  对于步骤B3f：不是将细胞裂解物转移到测定板上，而是将它们转移到闪烁计数管中。不需要离心。
4. 离心后，将分泌缓冲液和细胞裂解物转移到新的闪烁计数管中并用闪烁计数器定量3 H-血清素。
建立NPY-维纳斯表达细胞系
我们已经产生了两个稳定的BON细胞系，H8和F6，表达DCV货物NPY-Venus（参见注释3的差异），可以从Martin Lab获得。或者，可以通过以下步骤产生表达NPY-维纳斯的细胞系。请注意，慢病毒包装和转导实验应在生物安全二级实验室进行，废物应按当地规定处理。
1. 慢病毒包装
  1. 将2.5×10 6个HEK293FT细胞分裂至每个10cm组织培养板，并在37℃在5％CO 2培养箱中孵育细胞过夜。
  2. 第二天早上，用以下方案转染HEK细胞以产生慢病毒：
  3. 转染后6-8小时，从细胞中取出培养基，并用病毒生产培养基（含30％FBS的DMEM，参见食谱）代替。
  4. 转染后24小时，再次用新鲜的病毒生产培养基替换。
  5. 转染48-60小时后，收集培养基并适当处理细胞。
  6. 低速（1000×g，5分钟）离心培养基以去除死细胞和细胞碎片，然后将上清液通过0.45μm孔膜过滤并收集在32ml无菌聚碳酸酯超速离心管中。 br />
  7. 在Ti70 Beckman转子中以33,000rpm（或11,000×g g），4℃超速离心2小时沉淀慢病毒病毒颗粒。
  8. 小心取出离心管，并在靠近底部的管外壁标记病毒颗粒的位置。
  9. 小心取出上清液，加入100μl冷无菌PBS覆盖病毒颗粒。在寒冷的房间（4°C）过夜孵育。
  10. 第二天早上，使用移液管重悬几次并将浓缩的病毒溶液（各20μl）分装到单独的管中。将病毒溶液储存在-80°C或立即使用。避免反复冻结和解冻。
2. 慢病毒转导
  1. 将1.5×10 4 BON细胞接种到96孔板的每个孔中（共5孔）。孵育过夜，以便细胞附着。
  2. 第二天下午，用下列慢病毒溶液替换培养基来转导BON细胞。
  3. 转导后18小时，删除含有慢病毒的培养基，并用新鲜的培养基替换。
  4. 转导后48-72小时，用荧光显微镜检查NPY-Venus表达。选择一个大多数细胞是健康的和荧光的单细胞筛选（见注4）。
3. 单细胞筛选
  1. 胰蛋白酶NPY维纳斯表达细胞，并制成一个细胞溶液。
  2. 用FACS分选仪（1细胞/孔）或连续稀释（0.5细胞/孔）将细胞接种到96孔板中。将平板置于37℃和5％CO 2的培养箱中。
  3. 大约一周后，检查平板并标记有一个克隆的孔。丢弃有多个克隆的空洞或井。
  4. 经常检查候选井并在必要时更换介质。当细胞生长成数百个细胞的聚集体时，用200μl移液枪尖端强力移液，以分散到单细胞中。
  5. 继续培养细胞，直到它们覆盖＆gt;一口井的50％面积。通过荧光显微镜检查细胞，选择表达NPY-Venus的克隆用于下一步。
  6. 将候选克隆分成三个独立的96孔板，孵育48小时。
  7. 使用两块盘子进行筛选。按照程序B中描述的步骤选择具有离子霉素刺激的高分泌百分比和用DMSO对照的低百分比分泌的克隆。
  8. 保留最好的克隆（1〜3）并丢弃其余的。展开细胞，在冷冻培养基中冷冻一些小瓶（参见食谱）并储存液氮。

数据分析

NPY-金星分泌分析
在缓冲液和细胞裂解物中，NPY-金星百分比分泌通过分泌到缓冲液中的NPY-金星的百分比除以总NPY-金星来测量。
1. 在空的缓冲液中减去背景荧光以计算上清液和细胞裂解物中分泌的NPY-金星。
2. 使用下面的公式来计算NPY-金星的分泌百分比。
3. 对照缓冲液处理下的NPY-金星基底百分比分泌应当低，并且在不同的siRNA处理之间没有显着变化。为了简单起见，我们简单地使用离子霉素刺激的NPY-金星百分比分泌作为受调节的胞吐作用的测量。
血清素分泌分析
以与NPY-金星相似的方式计算3 H-血清素百分数分泌。

5-羟色胺的基础分泌通常远大于NPY-Venus测定中的分泌，因为该方案不能非常广泛地洗涤细胞并且将残余3 H-血清素转移到分泌缓冲液中（参见注释5）。因此，我们总是测量刺激和基底分泌，并使用差异（称为“Ca2 +依赖性分泌”）作为调节性胞吐的测量（见图2）。

图2. BON细胞中的血清素分泌测定。用Ca2 +依赖分泌来表示胞吐水平。每次治疗n = 5。

笔记

该方案使用终浓度为50nM的siRNA。最佳的siRNA浓度取决于特定的siRNAs，可能需要进一步优化。
在DMSO存在下测量5-羟色胺背景分泌是重要的，因为在洗涤步骤中由于残留3 H-血清素的保留，背景分泌高。
BON细胞克隆H8（克隆H8）稳定表达NPY-金星和质膜蛋白TfR-mcherry。 TfR-mcherry只含有转铁蛋白受体（TfR）的膜靶向结构域，内吞信号发生了突变。 BON细胞克隆F6只表达NPY-维纳斯。
我们选择2号井，但可能会因慢病毒颗粒的浓度而有所不同。
通过在刺激前多次洗涤细胞可以使基础3H-血清素分泌最小化。然而，更多的细胞可以通过多次洗涤而损失，并且可测量的3 H-血清素信号可以被减弱。

食谱

BON细胞培养基
用相同体积的F12营养素混合DMEM
添加FBS（PHENIX Research，无热失活），使最终浓度为10％，并储存在4°C。
汉克的缓冲区
将以下组件溶解于H 2 O
中

用HCl或NaOH溶液调节pH至7.4〜7.5，使总体积达到5L 分装到500毫升的瓶子和高压灭菌器
加无菌EDTA终浓度为1 mM
在室温下储存。
PSS-Na

用NaOH溶液调节pH至7.4，并保存于4℃
L-抗坏血酸溶液
将H-溶液中的L-抗坏血酸溶解至终浓度150mM。
调整pH值为5-6
通过一个0.2微米的膜过滤消毒
在-20°C储存
HEK细胞培养基
加入FBS（Thermo Fisher Scientific，无热失活）到DMEM中，最终浓度为10％，储存在4°C。
病毒生产介质
添加FBS（赛默飞世尔科技，无热灭活）到DMEM终浓度为30％
准备新的解决方案之前使用
HBeS（2x）

用NaOH溶液调节pH至7.05，过滤0.2μm膜，在4°C灭菌并保存。
CaCl 2 解决方案
溶解CaCl 2 2以在H 2 O中形成2.5M溶液
通过0.2μm膜过滤消毒并保存在4°C
硫酸鱼精蛋白
溶解硫酸鱼精蛋白在H 2 O中制成1mg / ml的溶液
通过0.2μm的膜过滤消毒并保存在4°C
冻结介质
将正常BON细胞培养基与细胞培养级DMSO（例如Sigma-Aldrich）以9：1的比例混合。
准备新的解决方案之前使用

致谢

这项工作得到了国立卫生研究院拨款DK040428，DK025861和GM119158（Martin，T.F.J.）的支持。 NPY-Venus分泌试验受Nagai等人（2002）的启发，由Bruinsma，S和Martin T.F.J. （未发表）。血清素分泌试验受到了Samuel Tran等人（2004）和Berwin等人的启发。（1998）。我们承认马丁实验室目前和以前的成员对开发测定的建议。作者声明没有竞争的财务利益。

参考

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