材料和试剂

50毫升聚丙烯管（Greiner Bio One International，目录号：227261）
Kimwipes
1.5毫升微管（Eppendorf，目录号：0030125150）
过滤泡沫MOLTOFILTER MF-13厚度5毫米（INOAC Corp.）
玉米（B73）
福尔马林（Wako Pure Chemical Industries，目录号：061-00416）
乙酸（Wako Pure Chemical Industries，目录号：017-00256）
乙醇（Wako Pure Chemical Industries，目录号：057-00451）
卢戈股票解决方案
碘化钾（Wako Pure Chemical Industries，目录号：166-03971）
碘（Wako Pure Chemical Industries，目录号：094-05421）
固定FAA解决方案（见食谱）
碘染色（Degenhardt等人，2010）（参见食谱）
25％卢戈尔工作解决方案（见食谱）

设备

X射线微CT成像系统（Comscantechno，型号：ScanXmate-E090S105）（图1）
1. X射线管：微焦点X射线源（Hamamatsu Photonics K.K.，型号：L9421-02）
2. 检测器：平板检测器（Varex Imaging，型号：PaxScan 1313DX）
  
  图1.本协议中使用的X射线显微CT成像系统

软件

coneCTexpress（内置于Micro-CT成像系统，Comscantechno Co. Ltd.，神奈川县，日本）
OsiriX MD v8.5（ http://www.osirix-viewer.com ，Pixmeo SARL，瑞士）
Imaris 8.2（英国Bitplane）（ http://www.bitplane.com ）
Adobe Premiere Pro CC（ http://www.adobe.com ，Adobe，美国）

程序

固定样品并用对比试剂染色
1. 玉米茎解剖和固定
  1. 种玉米植物6-8周。我们的生长条件是在温度为26°C，温室14小时，10小时的条件下。在6周时，已经发生了茎尖分生组织的花转变，并且流苏原基正在发育。
  2. 解剖玉米芽〜10厘米长的部分（图2）。确保在这个地区包括芽尖。随着节间变得越来越短，我们可以假设茎尖的近似位置。
    
    图2.固定在FAA的玉米茎样品
  3. 将样品放入50ml锥形管中，并用FAA溶液填充管（见食谱）。
  4. 缓慢抽真空，直到样品中出现小气泡，然后密封反应室。 15分钟后，缓慢释放真空压力。
  5. 释放真空后，用新的FAA更换溶液。将样品再次抽真空15分钟。
  6. 用新的FAA替换溶液，并将样品在4°C保存至少1周。 G。用70％乙醇替换FAA，并在4℃下旋转样品管3小时。用新的70％乙醇代替70％乙醇。
    将样品储存在4°C的70％乙醇中直至观察注意：含有甲醛的FAA和70％EtOH必须按照您所在学院/大学和当地政府的规定进行处理。
2. 样品用对比试剂染色
  1. 用35％EtOH替代70％EtOH，并在室温下孵育2小时
  2. 弃去35％EtOH，并将样品在室温下在蒸馏水中孵育1.5小时。用新鲜的蒸馏水重复这个步骤两次。
  3. 用25％的Lugol溶液替换水（参见食谱）并抽真空15分钟。
    在室温下在黑暗中将样品染色6天注：染色持续时间取决于组织的类型和大小。在详细观察之前检查染色（请参阅步骤C2）。对于玉米茎，需要6天（图3）。
    
    图3.用Lugol溶液染色的玉米茎的时间过程观察将玉米茎在25％卢戈溶液中染色1天（A），2天（B），4天（C）和6天（D）使用显微CT扫描。这些图像被处理并显示在OsiriX中。比例尺= 5毫米。
安装样品
1. 将湿Kimwipes和过滤泡沫放在50毫升锥形管底部。
2. 把染色的玉米茎放在管的中心。确保插入样品，使样品的下侧到达管的底部（图4A）。
  注意：
  1. 下游数据分析中使用的软件（OsiriX和Imaris）将导入的数据上下颠倒显示。为了避免繁琐的数据处理来纠正这个问题，我们只需将样品倒挂。
  2. 由于Lugol染色从组织迅速释放到水中，只需用纸巾除去多余的溶液即可。不要用水冲洗样品。
  3. 在数据采集过程中，样品将在微型CT设备的舞台上旋转。将样品置于舞台中央以获得高分辨率的图像很重要。
3. 在过滤器泡沫和湿Kimwipes放在样品的另一端，并关闭管。
  注意：Lugol染色后，玉米茎变软。轻轻处理样品以避免变形。同时，确保放置足够湿的Kimwipes和过滤泡沫，使样品不会在管中移动。数据采集过程中样本的移动会导致图像模糊。此外，管中的水分对于避免样品干燥和变形非常重要。
  
  图4.安装用于显微CT扫描的玉米杆。：一种。使用湿Kimwipes和过滤泡沫将染色的玉米茎放置在50ml聚丙烯管中。 B.用一块粘土将管子连接在微型CT扫描仪的台上。
数据采集
1. 在微型CT设备的样品台上放一块粘土，并将样品管紧紧地固定在粘土上（图4B）。
2. 将电压设置为90 kV，电流设置为85μA。关闭设备的门并打开X光。现在，您可以看到荧光透视图像监视器中显示的示例。为了使显示器内的显像管内部结构可见，请缩小透视图像的亮度窗口。如果样本染色不够，可以在此处看到显示器顶端的圆锥形状（图5）。确定茎尖的位置。
3. 旋转舞台检查样品。调整管角度，使样品在中心与台上成直角（图5A）。
  
  图5.扫描前的X射线透视成像A.安装在平台上的茎样品。请注意，茎样本是倒挂的。（B）中的黄色框表示放大的区域。 B.（A）中的盒装区域的放大。虚线和圆圈分别描绘了一个年轻的茎和流苏原基。图像从（A）旋转了180°。
4. 将亮度窗口返回到其全部范围。
  注：我们调整了亮度窗口，使样品在显示器上可见。在数据采集中，亮度窗口应该是全范围。
5. 确定扫描区域并设置扫描参数（，表S1 ），这取决于您的实验目的。这是数据采集区域和分辨率之间的一个折衷（如图6所示）。
  
  图6.使用不同分辨率的微CT扫描的玉米茎图像。：一种。茎的垂直部分。（c）（d）和（e）分别表示（C），（D）和（E）中的放大区域。是。茎的横切面。（A和B），（C），（D）和（E）中的分辨率分别为67.7,30.0,17.0和10.0μm/像素。扫描中的详细设置在表S1中提供。
6. 扫描样品。
  注意：当样本量大于数据采集的面积时，视野外的周围组织会产生各种噪声（图6E）。如果需要更高的分辨率，修剪样品以去除周围的组织/器官将减少数据中的噪音（见下文）。
7. 如果有必要，删除叶和茎揭露你感兴趣的部分。为了安装更小的样品，我们使用适当尺寸的微管。把湿的Kimwipes和过滤泡沫固定在试管内（图7）。
  
  图7.在1.5ml试管中固定修剪过的玉米杆A.A。从雄穗样品中取出第十和第十一片叶，从图2所示的茎中取出。B.第九和第八片叶被进一步去除。 C.显示装在1.5ml管中的修剪的玉米茎的图。红色箭头表示样本的支持点。
8. 使用高分辨率设置扫描样本（ Table S2 ）。图8显示，修整样本大大降低了噪音，并能够提高分辨率。
  注：微CT图像的分辨率可以通过增加帧平均数和投影数来进一步改善（因此也可以是扫描时间）（ Table S2 和图9） em>
  
  图8.通过微调样品获得的改进分辨率的微CT图像A，C和E.未修剪的（A）和修剪的（C和E）茎的横向切片。 B，D和F。未修剪的（B）和修剪的（D和F）茎的纵向切片。绿色的虚线表示以横截面显示的平面。图2,7A和7B中的茎样品分别对应于（A和B），（C和D）和（E和F）中的微CT图像。比例尺= 1毫米。
  
  图9.通过增加帧平均数和投影数量获得的进一步提高的分辨率的微CT图像扫描玉米梢尖的微CT图像9.5分钟（AC）和26分钟（DE）。 A，B，D和E.横向部分。 C和F纵向部分。注意，与（A-C）相比，用黄色虚线包围的维管束在（D-E）中变得更加可区分。绿线（a），（b），（d）和（e）分别表示（A），（B），（D）和（E）所示横断面。平均帧数和投影数量的详细设置显示在表S2 。比例尺= 1毫米。
9. 原始数据将被保存为.raw文件。将原始数据导入到micro-CT系统中的内置重建软件（例如，coneCTexpress）中。修剪空白处，确定冠/矢状切面的轴，使用降噪滤波器降低噪声，并将原始数据转换为8位Tiff图像。保存重建的Tiff图像数据集。
  注意：为了比较多个样本，在这一步中统一的设置将是非常重要的。
10. 在将Tiff文件导入图像分析软件OsiriX之前，我们将它们重命名为：Date_sample_resolution（μm）_number.tiff。这很重要，以便OsiriX以正确的顺序读取图像文件。
从微CT数据构建扫描电影
在这里，我们介绍如何使用OsiriX软件制作扫描电影，探索微CT数据（视频1）。

视频1
1. 要导入Tiff图像数据，请在OsiriX的首选项中禁用“仅导入DICOM文件格式”选项。（顶部菜单“OsiriX MD”→“首选项”→“数据库”图标→“文件管理窗口”→取消选中“仅导入DICOM文件格式”框）。
2. 导入Tiff图像。（“导入”图标→选择数据文件夹→“复制链接”）
3. 要显示导入的数据，请选择“文档数据库窗口”中显示的数据文件，然后单击“2D查看器”图标。然后，从顶部菜单的“3D查看器”中选择“3D体绘制”，并在像素X，Y和切片间隔（图10A）的字段中输入分辨率信息。
  注意：
  1. 如果OsiriX发出错误信息，请点击“继续”。
  2. 分辨率的单位是毫米/像素。将以μm/像素为单位的分辨率转换为mm /像素（例如30μm/像素→0.030 mm /像素）。
4. 点击“确定”后，将打开一个新窗口。关闭这个窗口。
5. 此时，“方向”图标变为活动状态（图10B）。现在，我们可以使用这个图标来设置显示屏中显示的2D部分的方向，并使用位于2D窗口上方的滑块来浏览部分。
6. 点击“窗口”图标并选择“3窗口”打开另外两个窗口（图10C）。按照步骤D3和D4所述输入这两个窗口的分辨率信息。使用“方向”图标在每个窗口中显示冠状，矢状和横切面（图10B和9D）。
7. 选择“WL / WW＆amp; CLUT“和”厚板“功能。我们的设置如下：
  WL / WW＆amp; CLUT（图10E（a））
  WL / WW（窗口级别/窗口宽度）：其他
  CLUT（颜色查找表）：B / W反转
  不透明度：线性表格
  厚板（图10E（b））
  模式：MIP
  滑块：5
8. 使用图10E（c），（d），（e）和（f）分别显示的工具，调整图像的WL / WW，位置，放大倍率和角度。
9. 要调整电影准备的每个窗口的大小和排列，请禁用“Magnetic Windows for move＆amp;调整”。（顶部菜单“OsiriX MD”→“首选项”→“查看者”图标→取消选中“磁性窗口移动和调整大小”）调整窗口大小和排列（如图10F所示）。另外，您可以使用图10E（e）所示的图标来更改每个窗口中的部分的放大率。
10. 导出电影文件。（选择一个横切面的窗口→'电影导出'图标→设置导出的数据区域为电影，并勾选'包括所有显示的2D查看器'（图10G），选择目录，设置格式和帧率。 →保存电影。
  注意：默认情况下，在“注释”功能区中选择“基本”选项，关于源数据的各种信息将显示在2D窗口中。您可以通过选中“图形”来禁用此设置。
  
  图10.利用OsiriX电影准备玉米干微CT数据以便于观察。品红框和圆圈突出显示在每个步骤中选择的图标，复选框和数字输入字段。 A.设置分辨率的窗口; B.方向图标; C.窗口图标选择“3个窗口”; D.三个窗口显示同一样本的不同部分。左，中，右窗分别显示冠状，矢状和横断面。 E.用于修改窗口外观的工具和图标。（a）WL / WW＆amp; CLUT，（b）厚板，（c）WL / WW，（d）位置，（e）放大率和（f）角度。 F.安排和调整窗口大小来制作电影。请注意，显示横断面的红框窗口被选中并激活。冠状面和矢状面窗口中的绿色条代表横断面所示的平面。 G.设置参数导出电影的窗口。
创建玉米茎血管网络的三维模型
在这里，我们使用Imaris提取静脉痕迹并重建玉米茎中的血管网络，Imaris是一种可用于各种3D数据分析（包括提取静脉等丝状结构）的软件。由于此程序包含许多手动操作步骤，因此我们提供视频来解释如何确定3D数据中的静脉痕迹（视频2和3）。
1. 在Imaris中制备玉米茎的3D模型
  1. 将连续的Tiff数据导入Imaris（Top Menu'Surpass'图标→'文件'→'打开'→在数据文件夹中选择第一个Tiff图像→'打开'视频2：0〜10秒） >
  2. 输入比例尺信息（顶部菜单'编辑'→'图像属性'→'几何'（图11A）→输入分辨率（μm/像素）→'OK'→输入分辨率后3D对象经常变得非常小调整并使用屏幕底部的“飞度”图标将对象贴在窗口上。视频2：12〜27秒）。
  3. 更改模型颜色。我们在这个例子中选择了白色。（顶部菜单'编辑'→'显示调整'→'频道1'（图11B）→'基本颜色'标签（图11C）→选择颜色视频2：33〜38秒）。
  4. 更改模型的大小和角度。（视频2：38〜43秒）
    注意：您可以分别使用鼠标左键，右键拖动和滚动操作来旋转，移动和放大/缩小导入的3D模型。
  5. 裁剪3D模型以确定分析的数据区域。在这个例子中，我们将茎切成四分之一圆柱（'设置'选项卡（图11D）→“混合”→顶部菜单“编辑”→“裁剪3D”→裁剪3D模型（图11E）→“确定”视频2：44秒〜1分13秒）。
  6. 保存裁剪的三维模型。（顶部菜单“导出”图标→输入文件名→“保存”视频2：1分14秒〜1分35秒）。
    
    图11.在Imaris中制作玉米茎的3D模型。品红框突出显示在每个步骤中选择的图标，复选框和数字输入字段。 A.几何窗口设置分辨率; B.显示调整窗口; C.颜色选择窗口; D.在选定的卷对象的属性区域中设置选项卡; E.裁剪3D窗口。
    
    视频2
2. 追踪静脉创建血管网络的三维模型
  静脉痕迹是节点中相对直线和节点上绕组线的组合。为了从micro-CT数据中做出静脉追踪，我们根据位置（节间或节点）将静脉分成几段，独立地提取它们并将它们合并成单一的迹线。
  1. 更改FilamentTracer的设置以手动提取静脉（顶部菜单'3D view'图标→'Filament'图标（图12A）→点击'跳过自动创建，手动编辑'（图12B）→'绘制'选项卡→检查'手动' “自动放置”和“XZ平面”（图12C中品红色盒子）视频3：0〜14秒）。
    注意：设置“XZ平面”是在步骤E2d的节间中提取静脉的垂直段。
  2. 默认情况下，选择对象列表区域中显示为“Volume”的卷对象。要显示XZ平面的切片，请取消选中“卷”，否则切片隐藏在卷对象后面。使用滑块（图12C和视频3：15〜24秒中的底部洋红色框）确定要跟踪的静脉。
  3. 在开始追踪静脉之前，请在“相机/标签”窗口中选择“选择”，然后通过转动电脑鼠标将线宽调整为静脉的宽度。鼠标指针周围的大小代表线宽。（图12D中的品红色盒子和视频3：26〜31秒）
    注意：这一步对Imaris来说很重要，可以根据3D数据的亮度有效识别静脉。
  4. 手动追踪节间中的一段静脉。（在“摄像机/标签”窗口（图12D中品红色框）中选择'选择'→按住'Shift'键的同时左键拖动来跟踪静脉。视频3：32〜43秒）。
  5. 编辑被跟踪线的宽度和颜色（线宽：'细丝'标签→圆柱体→输入宽度（图12E，例如，150）线条颜色：“颜色”标签→'基地“→改变颜色（图12F）。视频3：44〜55秒）。
  6. 根据三维数据的亮度校正曲线（“编辑”选项卡→“段”→单击并选择描迹线（线颜色为黄色）→“中心”（图12G中的品红色框）。视频3：56秒〜1分04秒）。
  7. 在节点（“绘图”选项卡→检查“手动”，“自动放置”和“XY平面”（图12C中的蓝色框）中手动跟踪横向运行的一段静脉）→确认段的开始和结束使用一个滑块（图12C和12H）在节点上的静脉→按照步骤E2c-E2f中所描述的那样跟踪片段并编辑线段视频3：1分05秒〜1分55秒）
  8. 如步骤E2c-E2f（视频3：1分58秒〜2分18秒）中所述手动跟踪下节间中的一段静脉。
  9. 加入上面两个部分（'Camela / Labels'窗口→检查'Navigate'（图12D中的蓝色框）→放大上部两个部分之间的连接点→在'Camera / Labels'窗口中选择'Select'图12D）→'编辑'选项卡（图12G中的蓝色框）→'点'→在按住'Ctrl'键的同时点击上部分的下端和下部分的上端，然后两端变成黄色→“加入”→点击一个蓝色的连接点→“删除”→按住“Ctrl”键点击新形成的结束→“加入”视频3：2分19秒〜2分42秒。 />
  10. 如步骤E2i所述加入下面两个段。（视频3：2分42秒〜3分00秒）
  11. 根据步骤E2f（视频3：3分05秒〜3分14秒）中所述的3D数据的亮度校正整个静脉轨迹。
  12. 重复步骤E2c-E2k来提取其他静脉的痕迹。提取的静脉网络的一个例子如图12I所示。
    
    图12.追踪静脉以创建血管网络的三维模型。品红框和圆圈突出显示在每个步骤中选择的图标，复选框和数字输入字段。蓝色框表示在后面的步骤中使用的那些。 A.长丝图标; B.在创建向导窗口中跳过自动创建的按钮; C.绘制标签; D.相机/标签窗口; E.设置标签; F.彩色标签; G.编辑标签; H.确认在节点中水平运行的段的开始和结束。顶部，中部和底部分别表示分段的开始，中间和结束。箭头指示要在节点切片中显示的要跟踪的静脉。 I.从玉米茎的微CT数据中提取的血管网。
    
    视频3

数据分析

微CT扫描的原始数据保存为.raw文件，并使用coneCTexpress转换为8位Tiff图像，如C9部分所述。使用OsiriX从这些tiff图像重建微CT扫描数据的3D模型（参见程序D）。如程序E所述，使用Imaris提取血管网信息。
在我们最初的研究中，我们观察到三个独立的生物学重复。应用学生t检验进行统计分析（Tsuda et al。，2017）。

食谱

固定FAA解决方案
福尔马林：醋酸：50％乙醇= 5：5：90
碘染色（Degenhardt et al。，2010）
注意：使用Lugol溶液进行碘染色的技巧在Gignac等人的文章中有详细描述。（2016）。
100％卢戈储备液
碘化钾10克
碘5克
蒸馏水（DW）至100毫升
25％卢戈工作解决方案
使用DW将100％储备溶液稀释至25％

致谢

我们感谢Mitsuhiko Kurusu（研究开发办公室国立遗传学研究所）组织的成像研讨会，这个研讨会促成了我们在这个项目中的合作，以及Akatsuki Kimura（国家遗传学研究所细胞建筑实验室）介绍和维护Imaris。我们也感谢Sarah Hake（加利福尼亚大学伯克利分校）提供的玉米茎样品。这项工作得到了JSPS KAKENHI Grant No. 17H00440至A.M.的支持。和K.K.的JP16K18637。这个协议是根据我们最近的工作（Tsuda et。，2017）改编的。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

Degenhardt，K.，Wright，A.C。，Horng，D.，Padmanabhan，A。和Epstein，J.A。（2010）。用碘染色显微CT检测小鼠胚胎心血管发育快速3D表型
Circ Cardiovasc成像 3（3）：314-322
Gignac，PM，Kley，NJ，Clarke，JA，Colbert，MW，Morhardt，AC，Cerio，D.，Cost，IN，Cox，PG，Daza，JD，Early，CM，Echols，MS，Henkelman，RM，Herdina AN，Holliday，CM，Li，Z.，Mahlow，K.，Merchant，S.，Muller，J.，Orsbon，CP，Paluh，DJ，Thies，ML，Tsai，HP和Witmer，LM（2016）基于扩散碘的造影增强计算机断层扫描（diceCT）：一种新兴的快速，分辨率，后生动物软组织的三维成像。 J Anat 228（6）：889-909。
Metscher，B. D.（2009a）。 MicroCT用于比较形态学：简单染色方法允许各种非矿化动物组织的高对比度3D成像。 BMC Physiol 9：11。
Metscher，B. D.（2009b）。 MicroCT for developmental biology：一种用于组织学分辨率高对比度3D成像的多功能工具。 Dev Dyn 238（3）：632-640。
Staedler，Y.M。，Masson，D。和Schonenberger，J。（2013）。通过X射线断层扫描植入3D组织：简单的对比方法可以进行高分辨率成像。
Tsuda，K.，Abraham-Juarez，M. J.，Maeno，A.，Dong，Z.，Aromdee，D.，Meeley，R.，Shiroishi，T.，Nonomura，K. I.和Hake，S.（2017）。 KNOTTED1辅助因子，BLH12和BLH14，调节玉米节间格局和静脉吻合。 < （Plant Cell） 29（5）：1105-1118。