材料和试剂

移液管吸头：GPR-10G（Mettler-Toledo，Rainin，目录号17001862），GPR-250（Mettler-Toledo，Rainin，目录号17001861），GPR-1000（Mettler-Toledo，Rainin，目录号17001859）
50毫升试管（Corning，Falcon ，目录号：352070）
Primo 真空过滤系统，250毫升，0.22微米，PES（Euroclone，目录号：EPVPE22250）
注射器过滤器PES 0.22μm过滤器（Euroclone，目录号：EPSPE2230）
培养皿（Corning，Falcon ，目录编号：351007）
MAX效能TMDH5αTM感受态细胞（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，产品目录号：18258012）
注意：您也可以使用自制的大肠杆菌DH5α感受态细胞（参见步骤E1）。
pCasRed质粒（Zerbini等人，2017），来自Addgene（Addgene，目录号：42876）的经修饰的pCas9质粒，可根据要求获得。
pCRISPR-SacB质粒（Zerbini等人，2017），来自Addgene的修饰的pCRISPR质粒（Addgene，目录号：42875），可根据要求获得。
T4多核苷酸激酶（PNK）（New England Biolabs，目录编号：M0201S）
T4多核苷酸激酶（PNK）反应缓冲液（New England Biolabs，目录号：B0201S）
用于克隆诱变性pCRISPR-SacB-gDNA的寡核苷酸1或gDNA正向（Sigma-Aldrich;脱盐，合成规模0.025μM）（参见程序B）
用于克隆诱变性pCRISPR-SacB-gDNA的寡核苷酸2或gDNA反向（Sigma-Aldrich;脱盐，合成规模0.025μM）（见程序B）
T4连接酶（New England Biolabs，目录号：M0202S）
10x T4连接酶缓冲液（New England Biolabs，目录号：B0202S）
1M NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S7653-1KG）
Bsa I酶（New England Biolabs，目录号：R0535L）
Dpn I酶（New England Biolabs，目录号：R0176S）
碱性磷酸酶，小牛肠（CIP，New England Biolabs，目录号：M0290S）
Wizard™SV Gel和PCR Clean-Up System（Promega，目录号：A9282）
QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN，目录号：27106）
ATLAS ClearSight DNA染色（BioAtlas，目录号：BH40501）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266-1KG）
注意：请参阅食谱准备100 mM工作溶液。
氯化钙二水合物（CaCl 2•2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C3306-250G）
注意：请参阅配方中有关15％甘油中100 mM工作溶液的准备。
GoTaq Green Master Mix，2x（Promega，产品目录号：M7123）
LB肉汤米勒（Sigma-Aldrich，目录号：L3522-1KG）
注意：请参阅配方以准备LB培养基。
LB琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：L2897-1KG）
注意：请参阅食谱准备与LB琼脂培养皿。
卡那霉素（Thermo Fisher Scientific，目录号：11815024）
注意：准备浓度为50毫克/毫升的股票（见食谱）
氯霉素（Sigma-Aldrich，目录号：C0378-25G）
注意：制备浓度为25毫克/毫升的原液（见食谱）。
L - （+） - 阿拉伯糖（Sigma-Aldrich，目录号：A3256-100G）
注意：制备浓度为20％L - （+） - 阿拉伯糖的原液（见食谱）。
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S5016-2.5KG）
注意：准备50％的蔗糖浓度的股票（见食谱）。
＆GT; 99％甘油（Acros Organics，目录号：158920010）
注意：准备75％的股票（见食谱）。
LB培养基（液体）（见食谱）
LB-琼脂（用于培养皿）（见食谱）
抗生素（见食谱）
20％L - （+） - 阿拉伯糖（见食谱）
50％蔗糖（见食谱）
75％的甘油溶液（见食谱）
无菌100mM MgCl 2（见食谱）
在15％甘油中的无菌100mM CaCl 2（参见食谱）

设备

移液器：Pipetman P2L金属喷射器（Gilson，目录号：FA10001M），Pipetman P10L金属喷射器（Gilson，目录号：FA10002M），Pipetman P20L金属喷射器（Gilson，目录号：FA10003M），Pipetman P200L金属喷射器：FA10005M），移液器P1000L金属喷射器（Gilson，目录号：FA10006M）
pH计（例如Fisher Scientific，型号：Fisher Scientific TM accumet TM AB150，目录号：13-636-AB150） >
-80°C冰箱用于储存菌株（任何市售冰箱都适合）
-20°C冰箱（任何市售冷冻机都适用）
高压灭菌器（例如，Tuttnauer，型号：5075 EL，160L）
低温，高达6000rpm的离心（例如，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Sorvall TM ST16） >
DNA测序仪（或DNA测序服务EUROFINS）
Gene Pulser / MicroPulser TM电穿孔比色杯，0.1cm间隙（Bio-Rad Laboratories，目录号：1652089）
MicroPulser TM Electroporator（Bio-Rad Laboratories，目录号：1652100）
温度至少30-37℃，摇动范围0-300r.p.m. （例如，Eppendorf，New Brunswick TM，型号：Innova 44）。
MilliQ水系统（例如，Elga Veolia，型号：PURELAB Flex 3）
分光光度计（例如，Biochrom，型号：WPA CO7500比色计）
Thermocell混合模块（例如，BionovaTec，型号：MB102）
用于PCR的热循环仪（例如Eppendorf，型号：Mastercycler nexus）
透射仪记录系统（例如，UviTEC剑桥实验室生命科学模型：UVIdoc HD5）

程序

通常，我们用于大肠杆菌的CRISPR / Cas9敲除方案使用三个主要组分：
1）pCasRed质粒（方法A）
2）pCRISPR-SacB-gDNA质粒（程序B）
3）致突变双链供体DNA寡核苷酸（程序C）。
＆NBSP;首先，我们用pCasRed质粒（1）进行转化，该质粒不仅编码Cas9核酸内切酶，而且还编码λRed机器（详见程序A）。在随后的步骤中，我们随后与pCRISPR-SacB-gDNA质粒（2）和诱变双链供体DNA（3）共转化。
＆NBSP;我们的方案通过将Cas9内切核酸酶引导至靶基因座的5'末端，通过特异性设计的指导RNA来编码并预先克隆到pCRSIPR-SacB-gDNA质粒中，从而使靶基因失活（详见程序B ）。在靶基因座处的DNA切割后，诱变双链供体DNA（ds-dDNA）允许红色辅助的双链断裂修复，从而引入框内终止密码子并除去邻近的原始间隔子motif （PAM）区域（图1）。图2显示了一个工作流程。
＆NBSP;如果需要的话，按照Hale等人的方法（2010），可以通过蔗糖选择来进行质粒治疗（其他参考文献参见Gay等人，1983; Steinmetz等人， 1983; Gay等人，1985; Murphy等人，2000）。简而言之，SacB基因编码来自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的果聚糖蔗糖酶（levansucrase），如果大肠杆菌在这种存在下生长，其将蔗糖代谢成毒性产物二糖。因此，细胞只有在失去了pCRISPR-SacB-gDNA质粒时才会生长。
＆NBSP;关于删除的长度和ds-dDNA的长度，您可以根据自己的需要调整此协议。在这里，我们通常描述30个核苷酸缺失，对应于使用70个碱基对的ds-dDNA的靶位点。然而，在我们的实验室中，我们观察到，长达2200个核苷酸的更长的缺失用120个碱基对的ds-dDNA更好地工作（Zerbini等人，2017年）。
＆NBSP;在开始之前，您应该从指南（程序B，图3），供体和引物（分别为程序C，图4和图5）的设计开始。我们建议在进入湿实验室程序之前订购它们。我们还建议参考我们原始研究论文（Zerbini等人，2017年）发表的寡核苷酸序列（目标位点，供体DNA，用于菌落PCR的引物），如果您想包括任何阳性对照你自己的实验。

图1.在大肠杆菌中的CRISPR / Cas9基因组编辑策略概述 A显示了在E中进行基因组编辑所需的全部三个主要组分。 1）表达λRed（Exo，Beta，Gam）机制，Cas9内切核酸酶和tracrRNA的pCasRed质粒; 2）编码gRNA和SacB基因的pCRISPR-SacB-gDNA质粒; 3）合成的双链诱变寡核苷酸（ds-dDNA）。转化后，tracrRNA与gRNA退火，其指定了Cas9的切割位点，在目标基因座产生三组分复合物，其中内切核酸酶活性介导染色体DNA双链断裂（B）。双链断裂随后通过在切割的染色体DNA和ds-dDNA（C）的末端之间发生λRed介导的同源重组来修复。

图2.在 E中基因敲除的示意性工作流程。使用CRISPR / Cas9技术的大肠杆菌。步骤1包括构建这个协议所需的三个主要组件（参见图1）。 E。（例如，大肠杆菌BL21（DE3））必须先用pCasRed质粒转化（注意星号，见步骤E4a.i）。大肠杆菌+ pCasRed菌株是诱变（步骤2）的起始点，其中制备新鲜的电感受态细胞（步骤E3）并直接用于转化（步骤E4）。第二天，进行菌落PCR以鉴定阳性敲除突变体（步骤E5和E6），随后将其接种在含有5％蔗糖的液体LB培养基中以固化之前使用的pCRISPR-SacB-gDNA（步骤3）。在这里，可以停止方案，或者继续进行另一轮诱变，仅遵循虚线框中突出显示的步骤2的步骤。图例：氯霉素（Cm），野生型（WT），阳性突变体（+），逃逸者（ - ）。

所需的质粒
1. 来自Addgene的pCas9质粒（＃42876）来自pCasRed质粒（Zerbini等人，2017），并且可以从我们的实验室根据请求获得。
  简而言之，pCasRed编码Cas9核酸酶，λ红（Exo，Beta，Gam）盒，反式激活CRISPR RNA（tracrRNA），并含有氯霉素抗性基因。该基因和tracrRNA编码序列处于组成型启动子的控制之下，而λRed基因盒使用阿拉伯糖诱导型启动子（pBAD）进行转录。
2. 可根据要求从我们的实验室获得pCRISPR-SacB质粒（Zerbini等人，2017）。它来源于pCRISPR质粒和来自Addgene的pKM154质粒（分别为＃42875和＃13036）。
  简言之，pCRISPR-SacB含有克隆位点，其允许在组成型PLtetO-1启动子下的两个重复序列之间插入自行设计的（参见程序B）编码所需引导RNA的合成DNA片段。它还携带与编码枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶的sacB基因融合的卡那霉素抗性基因（Km R ）。
选择Cas9靶位点和构建pCRISPR-SacB-gDNA质粒
注意：选择Cas9靶位点对于避免Cas9核酸内切酶的脱靶效应是至关重要的。图3说明了如何识别目标网站。
1. 识别目标基因内的PAM序列（5'-NGG-3'）
  注：PAM区域应接近5'端，因为该方案旨在通过灭活靶基因实现敲除。
2. 选择所识别的PAM序列（原型间隔子）和BLAST（Altschul等人，1990）上游的30个碱基对（bp），针对E。大肠杆菌BL21（DE3）基因组（GenBank登录号 CP010816 ）（或任何其他紧张你要使用）。
  注意：确保这30个碱基对不包含在接近PAM的10-12个核苷酸中定义为种子区域的任何互补核苷酸。
  此外，为避免脱靶效应，所选序列的剩余PAM远端部分应与其余基因组的任何其他区域共享少于15％的同源性。
3. 如上所述，订购两个互补的单链合成寡核苷酸覆盖原始空间减去PAM区域，另外五个额外的核苷酸以在随后的克隆步骤（例如参见图3）中支持连接。将编码基因特异性指导RNA。
  
  为了设计指导DNA（gDNA）来鉴定PAM序列（5'-NGG-3'，其中N代表任何一种基因特异性的Cas9靶位点）在靶基因的5'末端附近的四个核苷酸）。然后，选择PAM区上游的30个核苷酸（原型间隔区）。将整个序列（原型间隔区+ PAM）（其将成为gDNA的正向寡核苷酸的核心）针对靶生物体的基因组进行BLAST。为了避免Cas9脱靶效应，对于剩余的原始间隔区中的10-12个PAM近端核苷酸（种子区域，绿色）中的“可靠的”gDNA应当不具有任何同源性，并且在剩余的原始间隔区域中不应当具有任何同源性基因组。最后，通过添加5个碱基对（红色）来完成所选择的原型间隔子+ PAM序列，以便于随后克隆pCRISPR-SacB-gDNA的连接，产生gDNA序列的正向寡核苷酸。 gDNA的反向寡核苷酸是原始间隔区+ PAM正向序列的反向互补序列，加入了5个碱基对（红色），正如对正向寡核苷酸所做的那样。
4. 必须如下将合成的DNA片段克隆到pCRISPR-SacB中：
  1. 使用T4 PNK磷酸化编码gDNA的两个互补的单链合成寡核苷酸。
    1μl寡核苷酸1（100μM）
    1μl寡核苷酸2（100μM）
    5μl10x T4连接酶缓冲液
    1微升T4 PNK
    42μlMilliQ水（终体积50μl）
    注意：如果寡核苷酸的浓度不是100μM（例如50μM），请确保寡核苷酸1和2（例如2μl）和MilliQ水（例如40μl）以获得50μl的最终体积。
  2. 在37°C孵育30分钟
  3. 对于退火，加入2.5μl1M NaCl至反应混合物中并加热至95℃5分钟。
  4. 只需关闭加热块（ ca。 2 h），让其缓慢冷却至室温。同时，继续执行步骤B4e-B4h。
  5. 用 Bsa I消化pCRISPR-SacB。
    10μlpCRISPR-SacB（100ng /μl，总量<1-2μg） 1μl Bsa I
    5μl10x NEB Buffer
    34μlMilliQ水（终体积50μl）
    注意：如果您的pCRISPR-SacB质粒被稀释到100 ng /μl以外的浓度（如50 ng /μl），请确保您调整质粒的体积（如20μl）和MilliQ水，24μl）以获得50μl的最终体积。
  6. 在37°C孵育1小时
  7. 使用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）去磷酸化消化的pCRISPR-SacB质粒。
    5μl10倍CutSmart缓冲液
    1μlCIP
    在PCR清洗柱（20 ng /μl，总量500 ng质粒）中清洗25μlpCRISPR-SacB质粒。
    19μlMilliQ水
    注意：如果将纯化的pCRISPR-SacB质粒稀释到20ng /μl（例如15ng /μl）以外的浓度，请确保将质粒（例如33.3μl）和MilliQ水例如10.7μl）以获得50μl的最终体积。纯化后的质粒浓度应不低于11.4 ng /μl！
  8. 在37°C孵育2小时
  9. 使用Wizard SV Gel和PCR Clean-Up System从反应混合物中直接纯化质粒。
  10. 为了产生pCRISPR-SacB-gDNA质粒，进行如下的最终连接步骤：
    3μl消化的pCRISPR-SacB（10ng /μl，总量<30ng质粒）
    2μl磷酸化双链gDNA（1μM）
    1μlT4连接酶
    2μlT4连接酶缓冲液
    12μlMilliQ水
    注意：您可以使用不同的体积，但要确保最终体积为20μl的浓度保持不变。
  11. 在室温下孵育2小时注意：如果您的时间不允许在同一天进行，您也可以在16°C孵育过夜。
  12. 使用连接反应（10μl）转化大肠杆菌DH5α化学感受态细胞以获得pCRISPR-SacB-gDNA质粒（参见步骤E2以通过热休克转化）。
    注意：如果您不想使用商业化的大肠杆菌DH5α细胞，您也可以制备您自己的一批化学感受态细胞（步骤E1）。
  13. 剧烈摇动（200转每分钟）在37°C孵育1小时。
  14. 在含有卡那霉素（50μg/ ml）的LB-琼脂（见配方）中加入转化混合物。
    注意：由于在这个阶段转化效率应该很高，所以不要将整个转化混合物进行平板培养，而只需要100μl或200μl。
  15. 在37℃孵育LB-琼脂平板过夜
  16. 从单个菌落接种含有卡那霉素（50μg/ ml）的5ml LB，并在37℃温育过夜。
  17. 使用QIAprep Spin Miniprep Kit从过夜培养物中分离质粒
  18. 使用引物（引物序列：5'-GCCCAGTCATAGCCGAATAG-3'）通过DNA测序分析质粒，用于在编码指南的插入片段的下游进行质粒退火。引物可以用于所有的pCRISPR-SacB-gDNAs，因此对于不同指南的每一个克隆都是通用的。
    如果是阳性，你的pCRISPR-SacB-gDNA质粒准备好进行下面的诱变步骤（步骤E4a.ii）。
用于PCR筛选的诱变供体DNA和引物的设计
1. 我们推荐设计诱变供体DNA（dDNA），通过去除原型间隔区和PAM区域（避免突变后的Cas9切割），导致目标基因内30个核苷酸（Δ30）的缺失。同时，框内终止密码子必须插入靠近靶基因的5'端，从而使其失活。注意编码终止密码子的三核苷酸在靶链上没有互补序列（图4）。在我们的手中，这个策略很好的实现了基因敲除。有关示意图，请参阅图4.请注意，删除的长度可以根据您的需要进行调整。但是，如果删除的时间较长，您可能还需要增加dDNA的长度。
  
  图4. dDNA的设计供体DNA（dDNA）的长度可以不同（例如，70或120个核苷酸，见文本）。为了删除鉴定到的Cas9切割的原型间隔区+ PAM区域（图3），dDNA的5'部分（35或60个核苷酸）必须与原始空间区域上游的序列互补，而dDNA的3'部分（35或60个核苷酸）必须与原始空间的下游序列互补。为了使转录物失活，插入框内终止密码子（TAA），并且PAM区（NGG）也被消除以防止通过Cas9的进一步切割。最后，设计反向互补寡核苷酸以获得双链dDNA。
2. 我们明确推荐使用双链诱变寡核苷酸（ds-dDNA），优选HPLC纯化级别，因为这大大提高了诱变效率（Zerbini等人，2017）。因此，设计正向和反向寡核苷酸。对于Δ30缺失，我们推荐长度为70个核苷酸的dDNA。
3. 最后，ds-dDNA是通过将总共20μl的每种互补寡核苷酸对10μg在95℃下退火5分钟并通过关闭加热块使反应混合物缓慢冷却至室温而产生的。退火反应通过在退火反应中加入500ng各单链寡核苷酸和1μg总DNA并通过使用ATLAS ClearSight DNA染色显现条带来验证。对应于单链寡核苷酸的条带必须在退火反应样品中消失。
4. 应该设计在诱变步骤（步骤E4a.ii）之后进行菌落PCR筛选所需的引物，以获得扩增的200bp的DNA片段，其片段长度理想地区分野生型菌落与突变菌落之间30bp缺失的差异。有关示意图，请参见图5.
  
  图5.菌落PCR的图示。用于PCR的正向引物和反向引物被设计成分别与原始间隔区+ PAM序列的上游和下游退火，导致野生型中〜200bp片段的扩增。根据缺失（例如Δ30）的大小，敲除突变体可以通过其较短的PCR片段（例如，〜170bp）与野生型（一个）。通过进行2％琼脂糖凝胶电泳（B）可以鉴定大小不同的PCR片段。图例：标记（M），野生型对照（*），突变体（+），野生型'逃生'（ - ）
细菌菌株和培养条件
注意：确保使用选择大肠杆菌菌株所需的正确抗生素。我们经常使用DH5α和BL21（DE3）毒株。
1. 对于任何实验性步骤，如果没有另外说明，在37℃剧烈摇动（200rpm）下在LB肉汤（Sigma-Aldrich）中培养大肠杆菌菌株。
2. 准备在LB +甘油（15-25％终浓度）你的菌株库存，并存储在-80°C。
  例如：1毫升的股票准备200微升的75％甘油，过夜后增加800微升你的菌株。
3. 在每个细菌操作步骤之前，从冷冻/甘油储备中的过夜培养开始
基因敲除使用CRISPR / Cas9
为了制备pCRISPR-SacB-gDNA质粒（参见步骤B4），我们推荐使用大肠杆菌DH5α细胞，其必须被制成化学感受态并经热休克转化（步骤E1和E2）。相反，你想用于所有的诱变实验的菌株应该准备电穿孔（步骤E3和E4），以提高转化效率。
在用pCRISPR-SacB-gDNA质粒（在步骤B4中产生）通过电穿孔转化之前，应首先用pCasRed质粒（来自步骤A1）通过电穿孔（步骤E4）转化该菌株。
1. 化学感受态细胞的制备
  1. Streak E。在LB-琼脂板上培养大肠杆菌DH5α并在37℃过夜孵育。
  2. 接种来自单个菌落的5ml LB培养基的预培养物（参见食谱），并在37℃剧烈摇动（200rpm）过夜孵育。
  3. 在LB（例如，50ml）中将过夜培养物稀释至0.1的OD 600nm，并在37℃下剧烈振荡（200rpm）孵育直至OD <
    达到了0.4-0.6的大约600nm（ ca。 2小时）。
  4. 将培养物转移到50ml管中，并通过在4℃，2,500×g下离心20分钟来收集细胞。
  5. 弃去上清液，将沉淀物重新悬浮于5ml冰冷的无菌100mM MgCl 2中。
  6. 将悬浮液放在冰上30分钟。
  7. 2,500×g离心20分钟收获细胞
  8. 弃去上清，轻轻地将细胞沉淀重悬于1ml冰冷的无菌100mM CaCl 2的15％甘油溶液中，制备110μl的等分试样。
    注意：如果您开始培养体积较高，请在15％甘油/ 50 ml起始培养基中保持10 ml 100 mM CaCl 2 2的比例以重新悬浮。
  9. 使用新鲜的等分试样通过热休克进行后续转化（见步骤E2）注意：如果剩余一些等分部分，则将其储存在-80°C。
2. 通过热休克转化
  1. 将50μl化学感受态细胞与10μl连接混合物混合（见步骤B41）。
  2. 保持反应混合物在冰上30分钟。
  3. 将细胞转移到42℃的热板上45秒。
  4. 保持细胞在冰上2分钟。
  5. 加入940μlLB，并在37℃剧烈振荡（200rpm）下孵育细胞1小时。
  6. 将细胞铺在含有适当抗生素（氯霉素25μg/ ml用于用pCasRed质粒转化或用50μg/ ml卡那霉素转化用pCRISPR-SacB-gDNA转化）的LB-琼脂平板上。
    注意：我们建议分别加入100μl和900μl的转化混合物，但是如果您愿意的话，您可以选择不同的体积（例如500μl或250μl）。
  7. 在37°C孵育过夜
  8. 计数殖民地，以确定您的化学感受态细胞的转化效率。
3. 电感受态细胞的制备
  1. 将您的大肠杆菌菌株涂在LB-琼脂平板上，37℃孵育过夜。
  2. 接种来自单个菌落的5ml LB培养基的预培养物（见配方），并在37℃剧烈摇动（200rpm，过夜）下孵育。
    注意：如果您已经进行了突变检测，请使用质粒治疗步骤中的过夜培养（请参阅步骤E7）。
  3. 在LB（例如，50ml）中将过夜培养物稀释至0.1的OD 600nm，并在剧烈摇动（200rpm）下在37℃孵育直至OD < （ ca。 2-3小时），达到0.6-0.8的大于600nm。
    注意：如果您从先前用pCasRed质粒转化的菌株中制备出感受态细胞，请确保您的培养基含有氯霉素（25μg/ ml）并添加L - （+） - 阿拉伯糖（终浓度为0.2％）在0.2nm的OD 600nm处诱导λRed基因的细胞。
  4. 将培养物转移到50ml试管中，并通过在4℃，4,100gxg离心20-30分钟来收获细胞。
  5. 弃去上清，并用50ml冰冷的无菌MilliQ水重悬沉淀。在4℃再次离心4,100×g 10分钟。重复这个洗涤步骤三次。
  6. 最后，用冰冷的无菌10％甘油洗涤沉淀，再在4℃，4,100×g下离心10分钟。
  7. 丢弃尽可能多的上清液。立即重悬细胞沉淀在250μL冰冷，无菌10％甘油和准备110μL等分。
    注意：如果您的培养体积较高，请保持250μl10％甘油/ 50 ml起始培养物的重悬比例。
  8. 新鲜的等分试样通过电穿孔进行后续转化（见步骤E4）注意：如果剩余一些等分部分，则将其储存在-80°C。
4. 通过电穿孔转化
  1. Electroporate50μL感受态细胞使用1毫米基因脉冲比色皿在1.8千伏与下列反应混合物之一：
    1ng的pCasRed质粒（见步骤A1）
    诱变步骤：
    100ng pCRISPR-SacB-gDNA（在步骤B4中制备）
    10μg相应的ds-dDNA（程序C中设计）。
    注意：您的对照应包含使用100 ng“空白”pCRISPR-SacB（参见步骤B2）的转化，而不添加任何ds-dDNA。
  2. 加入950μlLB，在30℃剧烈摇动（200rpm）孵育细胞3小时。
  3. 将细胞铺在含有氯霉素25μg/ ml（当进行诱变步骤时为50μg/ ml卡那霉素）的LB-琼脂平板上。
    注：我们建议将诱变步骤的整个转化混合物（1ml）接种，但是如果您愿意的话，您可以选择不同的体积（例如500μl或250μl）。
  4. 在37°C孵育过夜
  5. 计数殖民地，以确定您electrocompetent细胞的转换效率。
    注意：你的诱变步骤的控制应该计算约。 106 CFU / ml /μg。至少三个数量级的转化效率的下降指示了gDNA的质量（Zerbini等，2017）。
  如果用pCasRed质粒转化，则开始返回步骤E3。
5. 菌落PCR
  1. 使用GoTaq Green Master Mix制备用于菌落PCR的主混合物。
    注：在我们的手中，筛选十个菌落就足够了（Zerbini等，2017）。因此，准备12个反应的主混合物（10个样品+ 1个对照，参见步骤E4a.ii的注释）
    11 x 1μl引物，正向（10μM）
    11×1μl引物，反向（10μM）
    11 x 12.5μlGoTaq
    11 x 10.5μlMilliQ水
  2. 使用移液器尖端挑选单个菌落，并直接转移到PCR反应混合物中。确保在浸入PCR反应管之前，接种到转移平板上的菌落中有足够的细胞用于进一步分析（见步骤E7和/或E8）。
  3. 使用以下设置启动PCR：
6. 通过在2％琼脂糖凝胶上加载4-8μl的每种PCR并运行电泳来验证突变体。使用Wizard SV凝胶和PCR清洁系统纯化阳性PCR扩增子（对照和样品之间的Δ30）。
  使用以上用于菌落PCR的引物之一，通过DNA测序确认突变。
7. pCRISPR-SacB-gDNA质粒的固化
  注：如果你打算进行多个淘汰赛，这一步是强制性的。但是，在您的基因组编辑实验结束时，除去pCRISPR-SacB-gDNA质粒是可选的。
  1. 为了去除pCRISPR-SacB-gDNA质粒，挑取突变的菌落（来自步骤E5b）并接种含有5％蔗糖（见食谱）和氯霉素（25μg/ ml）的液体LB培养基。
  2. 在剧烈摇动（200转/分钟）的条件下37°C孵育过夜
  3. 准备一个甘油库存的生成菌株存储在-80°C。
    注意：如果您希望继续随后的突变循环，请使用过夜培养物制备感受态细胞，返回步骤E3 。
  4. 通过将10-20μl滴加到两个LB-琼脂平板（一个含有氯霉素（25μg/ ml），另一个含有氯霉素和卡那霉素（25μg/ ml和50μg/ ml））来控制pCRISPR-SacB- ，分别）。在Cm和Km组合的平板上不应看到生长，表明所有的细菌已经失去了pCRISPR-SacB-gDNA质粒。
8. 固化pCasRed质粒
  注意：这一步是可选的。如果敲除实验结束后pCasRed质粒的存在可能会对下游实验产生负面影响，则需要进行此操作。但是，除去pCasRed质粒后，可能需要添加选择标记（即抗生素抗性）。
  1. 为了去除pCasRed质粒，挑选突变菌落（来自步骤E5b）或使用甘油原液接种在不含任何抗生素的LB培养基中，并在37℃剧烈摇动（200rpm）过夜孵育。
  2. 通过接种含有氯霉素（25μg/ ml）的LB-琼脂平板确认pCasRed质粒的丢失。使用氯霉素时不应该看到生长，表明所有细菌都已经失去了pCasRed质粒。

数据分析

为了验证突变是否已经成功获得，必须进行菌落PCR（参见步骤E5），随后使用2％琼脂糖凝胶通过凝胶电泳进行分析（参见步骤E6）。可以使用凝胶文件系统观察和记录尺寸变化（图5）。如果殖民地的结果是有一个片段等于野生型控制，它是一个所谓的（Jiang等人，2013年）。
最后，还必须使用在菌落PCR中使用的基因特异性引物之一进行DNA测序（步骤E5）以确认突变。

食谱

LB培养基（液体）
1. 称取25克LB肉汤米勒粉
2. 加入MilliQ水至1L的最终体积
3. 搅拌直到溶液完全溶解
4. 高压灭菌介质
5. 在室温下储存溶液
LB琼脂（用于培养皿）
1. 称取20克LB琼脂粉末
2. 加入MilliQ水至最终体积为500 ml
3. 搅拌直到溶液完全溶解
4. 高压灭菌介质
  注意：如果不立即倒入平板，请将介质存放在室温下。
5. 在加入抗生素和混合物之前，让培养基冷却至45-50°C。
6. 将培养基倒入培养皿中（ ca。 10-15 ml）
7. 将您的LB琼脂平板存放在4°C
抗生素
注意：我们建议为每种抗生素准备1,000x库存液的等分试样。将它们储存在-20°C。
1. 氯霉素：25毫克/毫升
2. 卡那霉素：50mg / ml
20％L - （+） - 阿拉伯糖
1. 称重10克L - （+）阿拉伯糖
2. 加入MilliQ水至最终体积为50 ml
3. 混合直至溶液完全溶解
4. 用0.22μm注射器过滤器消毒溶液
5. 在室温下储存
50％蔗糖
1. 称100克的蔗糖
2. 加入MilliQ水至最终体积为200 ml
3. 混合直至溶液完全溶解
4. 用Primo 真空过滤系统消毒溶液，0.22μm，PES，250 ml
5. 将解决方案存储在RT
75％的甘油溶液
1. 取75毫升高压灭菌的100％甘油
2. 添加25毫升高压灭菌MilliQ水
3. 彻底混匀
注：100％的甘油非常粘稠。
100mM MgCl 2
1. 称取95.21 mg MgCl 2并溶于10 ml MilliQ水中
2. 充分搅拌
3. 用0.22μm注射器过滤器消毒溶液
在15％甘油中的100mM CaCl 2
1. 称取147.01mg CaCl 2•2水合物并溶解于8.5ml MilliQ水中
2. 加入1.5毫升无菌100％甘油
3. 充分搅拌
4. 用0.22μm注射器过滤器消毒溶液

致谢

我们要感谢通过分配给Guido Grandi的高级ERC拨款OMVac 340915提供的这个项目的财务支持。这笔资金使我们能够建立这个协议，这个协议以前已经发表在微生物细胞工厂（Zerbini等人，2017）。
此外，我们感谢质粒保藏Addgene，它提供了我们修改用于我们的目的的质粒pCas9和pCRISPR的途径。最后，重要的是，我们要感谢Renate Weizbauer在这里发表我们的协议。
我们声明不存在与本文相关的任何利益冲突或利益冲突。

参考

Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W。和Lipman，D.J。（1990）。基本的局部比对搜索工具。 J Mol Biol 215 （3）：403-10。
Datta，S.，Costantino，N.和Court，D.L。（2006）。一组用于革兰氏阴性菌的重组工程质粒
379：109-115。
Ellis，H.M.，Yu，D.，DiTizio，T.和Court，D.L。（2001）。使用单链寡核苷酸的染色体DNA的高效诱变，修复和工程化。美国国家科学院院士98（12）：6742-6746。
Gay，P.，Le Coq，D.，Steinmetz，M.，Berkelman，T。和Hoch，J.A。（1985）。在Gam阴性细菌中包埋插入序列元件的阳性选择程序 J Bacteriol 164（2）：918-921。
Gay，P.，Le Coq，D.，Steinmetz，M.，Ferrari，E。和Hoch，J.A。（1983）。克隆结构基因sacB ，编码外切酶的果聚糖蔗糖酶枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）：该基因在大肠杆菌（Escherichia coli）中的表达。 J Bacteriol 153（3）：1424-1431。 >
Hale，L.，Lazos，O.，Haines，A.和Thomas，C.（2010）。取代稳定细菌质粒的高效无压力策略 Biotechniques 48（3）：223-228。
Iyama T.和Wilson III，D. M.（2012）。分裂和非分裂细胞的DNA修复机制 DNA修复 12（8）：620-636。
Jiang，W.，Bikard，D.，Cox，D.，Zhang，F。和Marraffini，L.A。（2013）。使用CRISPR Cas系统进行RNA指导的细菌基因组编辑 Nat Biotechnol 31（3）：233-239。
Jinek，M.，Chylinski，K.，Fonfara，I.，Hauer，M.，Doudna，J.A。和Charpentier，E。（2012）。具有适应性细菌免疫的可编程双重RNA引导的DNA内切核酸酶科学 337：816-821。
Ledford，H。（2015）。 CRISPR，干扰者自然 522： 20-24。
Marraffini，L.A。（2015）。原核生物的CRISPR-Cas免疫力 Nature 526： 55-61。
Murphy，K.C。（1998）。利用噬菌体λ重组功能促进大肠杆菌中的基因置换。 J细菌醇180（8）：2063-2071。
Murphy，K.C.，Campellone，K.G。和Poteete，A.R。（2000）。大肠杆菌中PCR介导的基因置换。 <基因 246（1-2）：321-330。
Muyrers，J.P.，Zhang，Y.，Testa，G。和Stewart，A.F。（1999）。通过ET重组快速修饰细菌人造染色体 Nucleic Acids Res 27（6）：1555-1557。
Pyne，M.E.，Moo-Young，M.，Chung，D.A。和Chou，C.P.（2015）。将λRISPR/ Cas9系统与lambda红色重组技术相结合可以简化大肠杆菌中的染色体基因置换。 Appl Environ Microb 81（15）：5103-5114。
Sander，J.D。和Joung，J.K。（2014）。用于编辑，调控和靶向基因组的CRISPR-Cas系统 Nat Biotechnol 32（4）：347-355。
Shuman，S。和Glickman，M.S。（2007）。通过非同源末端连接进行细菌DNA修复 Nat Rev Microbiol < 5（11）：852-861。
Steinmetz，M.，Le Coq，D.，Djemia，H.和Gay，P。（1983）。分泌酶的结构基因 sacB 的遗传分析，果聚糖蔗糖酶枯草芽孢杆菌 Marburg。 Mol Gen Genet 191（1）：138-144。
Wright，D.G.，Castore，R.，Shi，R.，Mallick，A.，Ennis，D.G。和Harrison，L。（2016）。结核分枝杆菌和海洋分枝杆菌同源末端连接蛋白可以一起起作用以连接大肠杆菌中的DNA末端。突变 32（2）：245-256。
Zerbini，F.，Zanella，I.，Fraccascia，D.，König，E.，Irene，C.，Frattini，LF，Tomasi，M.，Fantappiè，L.，Ganfini，L.，Caproni，E.，Parri ，M.，Grandi，A.，Grandi，G。（2017）。在大肠杆菌中大规模验证基于CRISPR / Cas的高效多基因编辑协议。 Microb Cell Fact 16：68。
Zhang，Y.，Buchholz，F.，Muyrers，J.P。和Stewart，A.F。（1998）。在大肠杆菌中使用重组的DNA工程的新逻辑（Nat Genet） 20（2）：123-128。