材料和试剂

纸巾
泡沫或软木板
硅管（Ø4.76x 7.94 mm2）（TOKYO RIKAKIKAI，EYELA，目录号：125540）
胶原蛋白I型涂层板
96孔板（IWAKI，目录号：4860-010）
24孔板（IWAKI，目录号：4820-010）
12孔板（IWAKI，目录号：4815-010）
6孔板（IWAKI，目录编号：4810-010）
100毫米碟（IWAKI，目录号：4020-010）
非涂层组织培养板
96孔板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：167008）
24孔板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：142475）
6孔板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：140675）
100mm培养皿（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：172931）
无菌棉纱（Osaki Medical Corporation，目录编号：15095）
100ml离心管（IWAKI，目录号：2355-100）
50ml锥形离心管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：339652）
不锈钢60μm细胞过滤器（Ikemoto Scientific Technology，目录号：802-570-01）
广泛无聊的P200尖端（赛默飞世尔科技，产品目录号：118-96RNS）
插管Ø1.2毫米（塑料外针配备静脉套管）（顶级公司，目录号：01151）
4-0无菌辫子丝缝合（秋山制药，产品编号：DEWB0404）
0.22微米过滤器（Stericup-GP），250毫升（Merck，目录号：SCGPU02RE）
25毫升移液器（Corning，Costar ，目录号：4489）
年龄在5周到20周的Wistar大鼠（可以使用雄性和雌性动物）
注意：所有动物实验必须符合国家和机构的规定。
PAS试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：395B-1KT）
ISOFLURANE吸入溶液（辉瑞公司，目录号：871119）
乙醇（Wako Pure Chemical Industries，目录号：054-07225）
E-MEM（Sigma-Aldrich，目录号：M4655）
Percoll（GE Healthcare，目录号：17089102）
PBS（ - ）（Nissui，目录号：05913）
TrypLE Express（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：12604013）
胎牛血清（FBS）（Gibco，目录号不可用）
注意：使用前，FBS应在56°C下热灭活30分钟。
冷冻保存的MEF（胚胎最初的小鼠胚胎成纤维细胞）（Merck，目录号：PMEF-CF）
CELLBANKER 1细胞冷冻培养基（Takara Bio，目录号：CB011）
液化氮
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：191-01305）
氯化钠（NaCl）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：192-13925）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4•2H 2 O）（和光纯药工业，产品目录号：192-02815） />
磷酸氢二钠十二水合物（Na 2 HPO 4•12H 2 O）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：196-02835） />
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G6152）
EGTA（DOJINDO，产品目录号：346-01312）
EDTA（DOJINDO，目录号：345-01865）
酚红（Sigma-Aldrich，目录号：P3532）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
氯化钙二水合物（CaCl 2•2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C7902）
胰蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich，目录号：T9128）
胶原酶（和光纯药工业，产品目录号：032-22364）
L-脯氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P0380）
氢氧化钠（NaOH）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：197-02125）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A9647）
人表皮生长因子（EGF）（Sigma-Aldrich，目录号：E9644）
地塞米松（100毫克）（和光纯药工业，产品目录号：047-18863）
抗坏血酸-2-磷酸酯（Asc2P）（和光纯药工业，目录编号：013-12061）
Y-27632（25mg）（RHO / ROCK途径抑制剂;抑制ROCK1和ROCK2）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：251-00514）
A-83-01（10mg）（活化素/ NODAL / TGF-β途径抑制剂;抑制ALK5，ALK4和ALK7）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：035-24113）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：276855）
CHIR99021（25mg）（WNT途径活化剂;抑制GSK3）（Axon Medchem，目录号：1386）
含有2.4g / L NaHCO 3和L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：11320082）的DMEM / F12。
DMEM，高葡萄糖，丙酮酸（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11995065）
抗生素/抗真菌溶液（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15240062）
胰岛素 - 转铁蛋白 - 丝氨酸（ITS）-X（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：51500-056）
烟酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：N0636）
重组小鼠制瘤素M（OsM）（25μg）（R＆amp; D Systems，目录号：495-MO-025）
Matrigel（康宁，目录号：354230）
0.5％（10x）胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15400054）
mTeSR TM 1（STEMCELL Technologies，目录号：85850）
盐酸（HCl）（35-37％）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：081-03475）
7.5％NaHCO 3溶液（见食谱）
预灌注缓冲液（见食谱）
0.05％酚红溶液（见食谱）
0.05％胶原酶溶液（见食谱）
2 M HEPES溶液（见食谱）
L-脯氨酸储备液（见食谱）
5N NaOH溶液（见食谱）
5％BSA储备液（见食谱）
10微克/毫升EGF储备液（见食谱）
10 -4 M地塞米松（见食谱）
1 M烟酰胺（见食谱）
100 mM Asc2P原液（见食谱）
Y-27632（5 mM）（见食谱）
A-83-01（2.5毫米）（见食谱）
CHIR99021（15 mM）（见食谱）
小型肝细胞培养基（SHM）（见食谱）
10微克/毫升小鼠OsM储备液（见食谱）
Matrigel股票（见食谱）
基质胶涂层板（见食谱）
0.05％（1x）胰蛋白酶-EDTA（见食谱）
步骤1的肝脏诱导培养基（HIM-1）（见食谱）
步骤2（HIM-2）的肝脏诱导培养基（见食谱）
步骤1的BEC诱导培养基（BIM-1）（见食谱）
步骤2的BEC诱导培养基（BIM-2）（见食谱）

设备

手术剪（任何公司的产品应该是罚款）
手术镊子（任何公司的产品应该是好的）
蠕动泵（TOKYO RIKAKIKAI，EYELA，目录号：RP-1000）
小动物麻醉机（室町机械，产品编号：MK-A110）
气密室（室町机械，货号：MK-TB1）
泡沫陷阱（内部准备）
CO 2培养箱（Panasonic Healthcare，目录号：MCO-170AICUVH-PJ）
紧凑型台式冷冻离心机（KUBOTA，型号：2800型）
血细胞计数器（改良Neubauer）（Sunlead玻璃，目录编号：A126）
微量移液器（Gilson，目录号：F123600，P20; F123601，P200; F123602，P1000）
单位水浴Thermominder SDminiN（TEITEC，型号：SDminiN，目录号：0068750-000）
磁力搅拌器（任何公司的产品都可以）
150毫升塑料储存瓶（康宁，目录号：431175）
冰箱（任何公司的产品都可以）

程序

计时
步骤1-18，准备大鼠初级MHs：2-3小时
步骤19，从初级MH诱导CLiPs：2周
步骤20-24，收获各种应用CLiPs：0.5-1小时
步骤25-29，CLiPs的肝诱导：11天
步骤30-34，CLiPs胆道诱导：12 d
步骤35-36，通过连续传代（直到达到P10），CLiPs的长期培养：2.5-4个月
步骤37-39，冻结CLiP股票：0.5-1小时

初级成熟肝细胞（MHs）的分离，时间2.5-3.5小时
注意：
1. 在开始之前，在室温下放置20毫升的E-MEM，这将用于消化提取的肝脏。
2. 在开始之前，将预灌注缓冲液和胶原酶溶液预热至38℃。
3. 在开始之前，将灌注速率设定为大约25-30毫升/分钟
1. 如图8所示设置灌注装置。
  
  图8.肝灌注的设备设置。上图显示了肝灌注装置的完整视图。底部面板呈现来自上部面板的详细图像。预灌流缓冲液和胶原酶溶液应升温至37°C。纸垫可以用任何材料如铝箔来改变。
2. 通过吸入异氟醚蒸气麻醉大鼠。在泡沫板或软木板上放一个纸巾垫，然后把鼠放在垫子上。通过用70％EtOH擦拭毛皮来消毒动物。
  用手术剪打开腹部暴露肝脏。
3. 在离分叉约0.5厘米的位置放置一个包裹门静脉的无菌缝合结（图9）。以25-30 ml / min的速率打开泵，开始滴注预灌注缓冲液（参见食谱）。在距离门静脉分叉约1.5厘米的位置半切断门静脉，插入套管。用缝线固定套管。
  
  图9.门静脉插管A.插管位置的示意图。公元前。用外科镊子穿透门静脉下方的组织，并在离分叉约0.5cm的位置用围绕门静脉的缝合线打结。 d-E。在离分叉约1.5厘米的位置用手术剪半切开门静脉。 F.将插管插入门静脉的切口。 G.系上缝线以固定套管。 H-1。暴露腔静脉，并用手术剪剪去血液。
4. 确认肝脏颜色从红棕色变为淡黄色后立即切开下腔静脉（图9和图10）。灌注大约450毫升预灌流缓冲液（大约15分钟）。
  
  图10.灌注前和灌注后肝脏的颜色变化
5. 暂停泵，将进口管转移到胶原酶瓶，并恢复灌注。灌注约300-350毫升胶原酶（约10分钟）。
6. 停止灌注，并从门静脉取出套管。将肝脏从腹腔切下，转移到100毫米的无菌塑料培养皿中。去除附着的周围组织，如隔膜和胰腺。
  注意：从这一步开始，在干净的工作台上执行所有程序。
7. 加入20毫升保持室温的E-MEM和20毫升剩余的胶原酶溶液（见食谱）。用手术剪将肝脏切成小于3毫米的小块。
8. 在CO 2培养箱中于37℃孵育切碎的组织15分钟。从培养箱中取出培养皿后，用25-ml移液管等大口径移液管轻轻吸取消化液数次，进一步分离剩余的组织。
  注意：如果留下大量未消化的碎片，请用无菌镊子将其取出。
9. 通过将消化的溶液转移到顶部装有单层纱布的100ml管中来过滤未消化的组织碎片。丢弃管顶部的单层纱布，并将过滤后的溶液转移到带有双层纱布的100ml管中。
  注意：
  1. 当纱布堵塞未消化的组织碎片时，用移液管从过滤器上去除堵塞的物质。
  2. 从这一步开始，所有的步骤都应该在冰上进行，所有的试剂应该保持在4°C或冰上。
10. 将过滤后的溶液分装到两个50毫升的试管中，通过倾析将E-MEM加入到每个试管中至多50毫升，并通过温和倒置混合。
  在57℃下将试管离心1分钟
11. 吸出上清液，并轻轻敲击管松开细胞沉淀。每管添加10毫升的E - MEM，并轻轻吹打几次重悬细胞沉淀。将每个管中的E-MEM倒入50毫升，并通过温和倒置混合。通过一个双网不锈钢细胞过滤器细胞悬液过滤到新的管。
  在57℃下将试管离心1分钟注意：当吸入MH悬浮液时，应使用宽口径移液管以避免由于广泛的剪切应力而损坏MH。
12. 吸出上清液，并轻轻敲击管松开细胞沉淀。加入10毫升完整的Percoll溶液到每个管，并轻轻吹打数次重悬细胞沉淀。将剩余的（大约28ml）Percoll溶液分装到每个管中，通过轻轻的倾析进行混合。
  在57℃下离心10分钟
13. 吸出上清液，并轻轻敲击管松开细胞沉淀。每管添加10毫升的E - MEM，并轻轻吹打几次重悬细胞沉淀。将每个管中的E-MEM倒入50毫升，并轻轻倒转混匀。
  在57℃下将试管离心2分钟
14. 重复上述洗涤程序（步骤13）。
15. 重悬细胞在15毫升SHM（ - ），结合2管，并测量细胞浓度。
16. （可选）如果广泛聚集干扰细胞计数，在细胞计数之前用40-μm细胞过滤器过滤细胞悬液。
  在使用和不使用这个过滤步骤分离的细胞之间，显微观察下的重编程效率没有区别
17. 将30μl的细胞悬液与120μl的SHM（ - ）混合以制备5倍稀释的细胞悬液。从稀释的细胞悬液中取出30μl，并与30μl台盼蓝混合。用血细胞计数器计数活细胞数和死细胞数。确定用于培养的悬浮体积。
18. 在SHM（+）中以约1×10 4细胞/ cm 2接种分离的MHs（如果需要，也可以使用SHM（ - ）作为对照）例如，将细胞以2.5×10 4个细胞/孔，5×10 4个细胞/孔和1×10 5个细胞/孔在24孔板，12孔板和6孔板中）。为了获得均匀播种的MH，大力来回摇动10次，然后左右10次。让平板静置15分钟，使MH下降到平板的底部，然后将平板转移到CO 2培养箱中。
  注意：由于MH的重量相对较重，小心保持细胞悬液均匀。在移液管中加入大量细胞悬液并将其释放到多个平板/孔中可能导致平板/孔之间的接种密度不一致。我们通常使用微量移液管直接将充分混合的未稀释细胞悬液（通常约3-8×10 6细胞/ ml）已经装满了SHM（+）。在细胞接种步骤中，通过定期翻转管混合细胞悬液，确保细胞悬液保持均匀。
使用小分子鸡尾酒YAC从初级MHs诱导CLiPs，时间2周
1. 培养初级MH后一天，用新鲜的SHM（+）代替培养基（如果需要，SHM（ - ）也作为对照）。此后，每2-3天更新一次。鉴于增殖性YAC（+）细胞是双电位的（参见步骤24-33），我们将这些细胞命名为化学诱导的肝脏祖细胞（CLiPs）。
为各种应用收获CLiP。步骤20-24。时间0.5-1小时。
当CLiPs达到70-100％汇合时，收获CLiPs以执行肝诱导（步骤25-29）或胆管诱导（步骤30-34），建立稳定的CLiP（步骤35-37），或者制备冷冻的股票以备将来使用38-40）。
1. 用PBS（ - ）洗板两次。
2. 加入0.05％胰蛋白酶-EDTA（参见食谱）或TrypLE Express（这两种试剂可以等同地用于收获CLiP），并在37℃下在CO 2培养箱中孵育，直到细胞从盘子。
  注意：
  1. 确保离解试剂完全覆盖培养区域。我们通常使用2毫升的解离试剂到一个100毫米的盘子，并使用其他文化规模相似的比例。
  2. CLiPs对胰蛋白酶消化是相对有抵抗力的，一般需要10-15分钟将它们从平板上分离下来。
3. 通过用P1000吸头移液进一步分离细胞，尽可能完全收集，并将其转移到15毫升或50毫升收集管中。
  注意：尽管对细胞有相对的破坏作用，但这一过程是必不可少的。与一般细胞系不同，即使细胞在胰蛋白酶消化后呈现出圆形形态，但它们中的许多仍然附着在培养板上，很少能通过直接将培养基施加到培养板上而收获。
4. 用5ml SHM + YAC（补充有5％-FBS（热灭活）或SHM + YAC）的胰蛋白酶-EDTA或TrypLE Express（TrypLE Express不需要中和酶活性）收集留在板中的细胞。 >
5. 使用血细胞计数器计数细胞数量，确定用于通过的悬浮体积，将所需体积转移到新管中，并在4℃下以200×g离心管5分钟。吸出上清液，并通过轻敲管松开细胞沉淀。用每个应用程序使用的介质重新悬浮细胞。
CLiPs的肝诱导（在P1）。步骤25-29。时间0.5-1小时，SHM（+）培养2天，肝脏感应8天。
对于初级CLiPs，我们通常使用培养2周（14-16天）的细胞。
1. 按照步骤20-24收获细胞，并获得所需体积的肝诱导细胞悬液。对于早期传代的CLiPs，我们将细胞以约5×10 4个细胞/ cm 2（1×10 5个细胞/孔和2个对于24孔板和12孔板，分别为10 5个细胞/孔）。
  在200℃下将管子在4℃下离心5分钟注意：细胞密度可以减小到1-2.5×10 4细胞/ cm 细胞/ cm 当稳定的CLiPs用于肝诱导时，
2. 吸出上清液，重悬细胞0.5或1毫升SHM + YAC补充5％胎牛血清，并种子分别胶原涂层24或12孔板。注：为了增加培养板上初级CLiPs的附着性，我们推荐使用5％FBS补充的SHM + YAC。
3. 接种后一天，用新鲜的SHM + YAC代替培养基，培养细胞2天。
4. 用HIM-1代替培养基（见食谱），继续培养6天。
  每隔一天更换一次新鲜的HIM-1
5. 用HIM-2代替培养基（见食谱），继续培养2天。
  注意：在使用前立即准备HIM-2。使用在4°C或冰上冷冻的P1000或200μL宽口径吸头。
胆道感染CLiPs。步骤30-34。时间0.5小时解冻MEFs，1天培养MEFs，0.5-1小时通过CLiPs，13天培养CLiPs BEC感应
通过主要CLiPs分化成BECs。
1. 在收获CLiP之前一天，在12孔胶原板上以5×10 4个细胞/孔将种细胞周期停滞的MEFs收集起来。简而言之，将解冻的MEF细胞在37℃水浴中解冻，并将悬浮液稀释在10ml 10％FBS-DMEM中。在200℃下在4℃下离心5分钟后，以5×10 4细胞/ ml重悬于10％FBS-DMEM中，并以1ml /一个12孔胶原板。
2. 在步骤20-24之后收获初级CLiP，并获得期望体积的用于肝诱导的细胞悬液。将细胞以5×10 5个细胞/孔在12孔板中接种。
  在200℃下将管子在4℃下离心5分钟
3. 吸出上清液，重悬细胞在1毫升补充5％胎牛血清的SHM + YAC，种子到预先接种的MEFs。
  注意：为了增加培养板上初级CLiPs的附着性，我们推荐使用5％FBS补充的SHM + YAC。
4. （步骤1）在第二天，通过用BIM-1代替培养基开始胆管诱导（参见食谱）。培养细胞6天，每隔一天用新鲜的BIM-1更换培养基。
5. （步骤2）用BIM-2更换介质（参见食谱）。将细胞再培养6天，同时每隔一天用新鲜的BIM-2更换培养基。
  注意：在使用之前立即准备BIM-2。使用P1000或在4°C或冰上冷冻的200毫升宽口。
通过不断传播的长期文化CLiPs。步骤35-36。时间2.5-4个月（直到达到P10）
CLiPs可以通过连续传代稳定培养;然而，增殖率暂时从大约P2下降到P7。在长期培养过程中，细胞可以冷冻备份或将来使用。＆nbsp;
注意：
1. CLiP在P2和P7之间经历了其增殖能力的短暂降低（如果不是它们进入完全衰老的话）。因此，在此期间，取决于实验批次，细胞需要15-40天才能获得30-60％的汇合度（图5）。
2. 开始传代之前，准备一个Matrigel包被的平板（我们通常使用35毫米，60毫米和10厘米的盘子进行细胞维护）。
初级CLiPs通常在14-16天传代。当P1和P2之间达到50-90％融合，P3和P7融合30-60％，以及50-90％汇合时，继代培养的CLiPs进一步传代。我们通常在早期传代（P1到P7）中将细胞接种在2×10 6个活细胞/ 10cm-培养皿中。然而，实际接种的细胞数远低于2×10 6活细胞/ 10cm培养皿，因为较早通道中的细胞不能有效地附着到平板上。一旦细胞增殖速率增加（通常在大约P6之后），我们将接种密度降低至1-10×10 5个细胞/ 10cm培养皿，使得它们在培养3-7天后变成亚汇合。
1. 收集步骤20-24之后的细胞，并获得所需体积的细胞悬浮液通过。
  在200℃下将管子在4℃下离心5分钟
2. 在合适体积的SHM + YAC中重悬细胞，在用Matrigel包被的所需板上种子，并在CO 2培养箱中培养细胞。介质应每1-3天更换一次。
冻结CLiPs库存。步骤37-39。时间0.5-1 h
1. 收获步骤20-24之后的细胞，获得所需体积的用于制备冷冻原种的细胞悬液（通常为0.5-10×10 6个细胞/小瓶）。
  在200℃下将管子在4℃下离心5分钟
2. 吸出上清液，并将细胞重悬于所需体积的CELLBANKER®1中。
  使用的CELLBANKER®1的体积为0.5 ml /瓶
3. 分装到配有螺帽的血清管中。密封瓶盖，并在-80°C至少保存一天。然后，将样品转移到液氮。

笔记

故障排除

食谱

7.5％NaHCO 3溶液
将7.5g NaHCO 3溶于100ml dH 2 O中。用0.22微米的过滤器过滤，并保存在4°C直到使用。在1个月内使用
预灌注缓冲液
1. 通过将以下试剂溶解在500ml蒸馏水中制备10x预灌注缓冲液原液：40g NaCl，2.0g KCl，0.39g NaH 2 PO 4 2H 2 O 0.76g Na 2 HPO 4•12H 2 O，4.5g葡萄糖，1.9g EGTA，3.7g EDTA，0.0030g酚红和11.9g HEPES
2. 该储备溶液可以在室温下储存。在使用前，用450ml dH 2 O稀释50ml 10x储备溶液制成1x溶液。
3. 高压灭菌后，加入2.35ml 7.5％NaHCO 3溶液和2ml 1N NaOH溶液。
0.05％酚红溶液
将0.05g酚红溶解在100ml dH 2 O中在室温下储存
注意：如果溶液中含有沉淀物，请在每次使用前将溶液与磁力搅拌器混合。
0.05％胶原酶溶液
准备1.2 L胶原酶基础溶液如下：
1. 将以下试剂溶于1.2L的补充有14.4ml 0.05％酚红溶液的dH 2 O：9.6g NaCl，0.48g KCl，0.094g NaH 2 PO 4， 4•2H 2 O，0.18克Na 2 HPO 4•12H 2 O ，2.86g HEPES，0.888g CaCl 2•2H 2 O和0.42g NaHCO 3。
2. 将此基础溶液储存在4°C直至使用
3. 灌注时，将400ml倒入烧杯中，用5N NaOH和/或6N HCl将pH调节至7-7.4。
4. 然后，溶解0.02克胰蛋白酶抑制剂和0.2克胶原酶
5. 用5N NaOH和/或6N HCl调节pH至7.6后，用0.22μm过滤器过滤，并在4℃下储存直至使用
注意：准备好的胶原酶溶液应在一周内使用。
2 M HEPES解决方案
将47.7g HEPES溶解在100ml dH 2 O中用0.22微米的过滤器过滤，并保存在4°C直到使用
L-脯氨酸储备液
将0.3克L-脯氨酸溶于10毫升PBS（ - ）中用0.22微米的过滤器过滤，并保存在4°C直到使用
5N NaOH溶液
1. 称量约20克氢氧化钠，并立即记录精确的重量
2. 计算灭菌dH 2 O（对于20g NaOH，需要100ml）所需的体积。
3. 在搅拌溶液的同时，将NaOH加入约80ml无菌的dH 2 O中
4. 在完全溶解NaOH后，用灭菌的dH 2 O将体积增加至所需的量，转移到塑料储存瓶中，并在室温下储存
注意：
1. 由于氢氧化钠容易变湿，请尽快测量重量。
2. 考虑到浓NaOH溶液溶解玻璃，请使用塑料瓶进行储存
5％BSA库存解决方案
将5克BSA溶于100毫升PBS（ - ）
使用0.22微米的过滤器进行过滤。避光保存，并保存在4°C直到使用
10μg/ ml EGF储备溶液
1. 通过用19.6ml PBS（ - ）稀释0.4ml的5％BSA制备20ml的0.1％BSA溶液，并溶解0.2mg的EGF。
2. 储存在-20°C的500微升等分直到使用
10 -4 M地塞米松
1. 通过将100mg地塞米松溶解在25.4ml乙醇中制备10 -2 M初级储备溶液，并将500μl等分试样储存在-20℃直至使用。
2. 为了制备50ml的工作储备溶液（10 -4 M），用49.5ml dH 2 O稀释500μl初级储备液。
3. 将工作原液在4°C下保存
1 M烟酰胺
将12.21克NA溶于100毫升PBS（ - ）
用0.22微米的过滤器过滤，并保存在4°C直到使用
100 mM Asc2P原液
将2.9克Asc2P溶于100毫升PBS（ - ）
用0.22μm过滤器过滤
避光保存，并保存在4°C直到使用
Y-27632（5毫摩尔）
将25mg的Y-27632溶解在14.8ml灭菌的dH 2 O中在-20°C储存1毫升等分直到使用
A-83-01（2.5mM）
1. 通过在949μlDMSO中溶解10mg A-83-01制备一级储备液（25mM），并在-20℃储存100μl等分试样。
2. 要准备工作储备溶液（2.5 mM），将900μlDMSO加入到一瓶原液中，并在-20°C储存100μl等分样品。
CHIR99021（15毫米）
加入3.58毫升DMSO到含有25毫克CHIR99021的小瓶中，并在-20°C储存100微升等分试样。
小肝细胞培养基（SHM）
1. 从500毫升的DMEM / F12瓶中取出27.3毫升
2. 去除的DMEM / F12可用于制备基质胶涂层板（见下文）
3. 向剩余的DMEM / F12中加入1.25ml 2M HEPES，500μlL-脯氨酸和5ml抗生素/抗真菌剂
4. 然后，加入250μl的5N NaOH以将pH调节至约7.5。然后，加入5ml 5％BSA，500μl10μg/ ml EGF，5ml ITS-X，500μl10 -4 M地塞米松，5ml 1M烟酰胺和5毫升的100毫米Asc2P
5. 在4°C储存
10μg/ ml小鼠OsM储备溶液
1. 通过用2.45ml PBS（ - ）稀释50μl5％BSA制备2.5ml 0.1％BSA / PBS（ - ）
2. 溶于25毫克小鼠OsM在2.5毫升的0.1％BSA的解决方案
3. 在-20°C储存100-μl等分试样直至使用
Matrigel股票
1. 在冰箱里过夜解冻一瓶Matrigel。准备在冰上0.5-1毫升等分试样
2. 储存在4°C的短期使用（2周内）或在-20°C以备后用
注意：使用前在4°C或-20°C使用Matrigel的冷冻吸头和移液器，因为高浓度的Matrigel在室温下容易凝固。
基质胶涂层板
1. 稀释Matrigel以16μl/ ml DMEM / F12
  的比例稀释
2. 加入大约0.1-0.2ml / cm 2的稀释的Matrigel溶液（我们通常将0.5ml，1ml，2.5ml和5ml加入到12孔板和24孔板的孔中，35 -mm盘，60-mm盘和100-mm盘）
3. 在37°C孵育20分钟
4. 在接种细胞之前用等体积的SHM（ - ）洗涤一次（我们通常将0.5ml，1ml，2.5ml和5ml加入到12和24孔板，35mm培养皿，60- mm培养皿和100mm培养皿）
0.05％（1x）胰蛋白酶-EDTA
用45ml PBS（ - ）稀释5ml的0.5％胰蛋白酶-EDTA，并在4℃保存直至使用。
步骤1的肝诱导培养基（HIM-1）
在50ml的SHM + YAC中加入100μl10μg/ ml OsM和500μl10 -4 M地塞米松。 OsM和地塞米松的终浓度分别为20ng / ml和10-6M。
第2步（HIM-2）的肝脏诱导培养基
注意：
1. 在使用前立即在冰上准备这种培养基。
2. 在使用Matrigel时，使用P1000吸头或在4°C冷冻或在冰上的宽口径P200吸头。
以7：1的体积比混合HIM-1和Matrigel。例如，对于24孔板或12孔板的一个孔，分别混合62.5μlMatrigel和437.5μlHIM-1（共500μl）和125μlMatrigel和875μlHIM-1（总共1ml） br />
用于步骤1的BEC诱导培养基（BIM-1）
BIM-1是补充了YAC的mTeSR TM 1培养基。准备完整的mTeSR™1培养基，加入100毫升的补充到400毫升的基础培养基，并添加每瓶YAC库存的解决方案
步骤2（BIM-2）的BEC诱导培养基
BIM-2是补充有2％Matrigel的BIM-1。使用前立即准备这种媒体。将1体积的Matrigel添加到49体积的BIM-1

致谢

我们感谢井上绫子的技术支持，酒井裕介和Takanobu Hara帮助我们准备在这个手稿中使用的照片。这项研究得到了日本医学研究和开发署（AMED）青年科学家B（16K16643）和肝炎研究计划（16fk0310505h0005）的部分支持。该方案已被用于细胞干细胞（Katsuda等人，2017）。提交人宣称没有利益冲突。

参考

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Kamiya，A.，Kojima，N.，Kinoshita，T.，Sakai，Y。和Miyaijma，A。（2002）。体外培养的胎儿肝细胞通过细胞外基质和制瘤素M诱导色氨酸加氧酶。

肝炎学 35（6）：1351-1359。
Katsuda，T.，Kawamata，M.，Hagiwara，K.，Takahashi，R.U.，Yamamoto，Y.，Camargo，F.D。和Ochiya，T.（2017）。将具有再生能力的终末期肝细胞转化为可培养的双能祖细胞细胞干细胞 20（1）：41-55。
Loyer，P.，Cariou，S.，Glaise，D.，Bilodeau，M.，Baffet，G。和Guguen-Guillouzo，C。（1996）。体外成年大鼠肝细胞G1期和S期进展的生长因子依赖性。在G1中后期有丝分裂限制点的证据。 J Biol Chem 271（19）：11484-11492。
Seglen，P.O。（1976）。制备分离的大鼠肝细胞方法细胞生物学 13：29-83。