材料和试剂

完全蛋白酶抑制剂混合物，无EDTA（Roche Diagnostics GmbH，目录号：11873580001），根据制造商的说明书制备为25x母液。
GST-Rhotekin（Millipore/Upstate，目录号：14-662）
GST-PAK1（内部）
抗-RhoA抗体（1:200）（Santa Cruz，目录号：sc-418）
抗Rac1抗体（1:200）（Santa Cruz，目录号：sc-95）
抗Cdc42抗体（1:500）（Santa Cruz，目录号：sc-87）
抗-GST抗体（1:2,000）（Santa Cruz，目录号：sc-138）
谷胱甘肽（GSH）琼脂糖4B（GE Healthcare Life Sciences，目录号：17-0756-01）
二硫苏糖醇（DTT）（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0611）
Triton X-100（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0407）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
Tris-HCl（pH 7.4）
NaCl
EDTA
NP40
Na 2
NaF
Na ₃ VO ₄
样品加载缓冲区
10％或12％SDS-PAGE凝胶
GST下拉核心缓冲区（见Recipes）
RIPA缓冲区（参见配方）

设备

离心机（Eppendorf，目录号：5415R）
营养搅拌机（Labnet International）
1.5 ml Eppendorf管
热块

程序

通过在补充有1％Triton X-100的RIPA缓冲液中在4℃孵育2小时来裂解细胞样品。以18,000×g离心10分钟。在4℃下收集澄清的粗细胞裂解液
转移15微升GSH琼脂糖凝胶到100微升GST下拉核心缓冲液在1.5毫升离心管中。充分混合并在835×g下旋转1分钟。。倾析上清液并保存洗涤的GSH-sepharose用于预清洗样品（步骤3）
通过加入300μlGST下拉缓冲液（通过补充含0.1％Triton X-100,1mM DTT和1×蛋白酶抑制剂的核心缓冲液制备）预清洗100μg粗细胞裂解物，所述缓冲液含有洗涤的GSH-琼脂糖在步骤2）中制备。在4℃下搅拌孵育1小时注意：如果有多个样品，首先使用相应的裂解缓冲液将100μg裂解液加至等体积以确保相等的输入。
在4℃下以835×g离心1分钟。转移上清到新的1.5毫升管，而不扰乱琼脂糖。将预澄清的裂解物的等分试样保存为"样品输入"
添加到上清中与30μgGST-Rhotekin（用于RhoA-GTP测定）或GST-PAK1（用于Rac1-和Cdc42-GTP测定）结合的30μl谷胱甘肽珠。通过添加GST预结合的琼脂糖类似地制备"仅GST"对照。混匀，在4℃下摇动培养2〜3小时。
在4℃下以835×g离心1分钟以沉淀sepharose珠。
吸出上清液（可选：保存上清液以进行下拉反应的质量控制）。
通过在4℃下加入300μl1×PBS洗涤沉淀的琼脂糖凝胶珠子
在4℃下以835×g离心1分钟并抽吸上清液（可选：将上清液保存为"第一次洗涤"，用于洗涤步骤的质量控制）。
重复洗涤。将上清液保存为"第二次洗涤"（可选）。
将样品加样缓冲液中的珠子煮沸5分钟。并旋转以收获下拉蛋白
通过SDS-PAGE（10％或12％凝胶）分离洗脱的蛋白质和一等份的细胞/组织裂解物（样品输入）。还可以包括上面收集的"上清液"，"第一次洗涤"和"第二次洗涤"的等分试样以进行质量控制。
然后使用抗RhoA，Rac1或Cdc42抗体进行Western印迹分析以检测活性（下拉）和总（输入）GTP酶。还用抗GST抗体探测印迹以确认成功的GST下拉，在样品之间具有相当的效率注意：Rhotekin和PAK1优先分别结合活性（GTP结合形式）RhoA和Rac1/Cdc42。这些试剂的质量控制可以通过将GST-Rhotekin（或GST-PAK1）与预装有GDP或不可水解的GTP-γS的重组RhoA（或Rac1/Cdc42）孵育来进行。

食谱

GST下拉内核缓冲区
20mM Tris-HCl（pH7.4） 150mM NaCl 1mM EDTA
RIPA缓冲区
50mM Tris-HCl（pH7.4） 150mM NaCl 1％NP40
1mM Na 2 P 2 O 7 sub
1 mM NaF
1mM EDTA
2mM Na 3+ VO 4

致谢

该协议改编自Li等人（2012）。

参考文献

Li，X.，Law，J.W.and Lee，A.Y。（2012）。 Semaphorin 5A和神经丛素-B3通过Rac1和肌动蛋白细胞骨架调节人类神经胶质瘤细胞运动和形态。/a> Oncogene 31（5）：595-610。