材料和试剂

移液枪头（SARSTEDT）
0.45μm消毒过滤嘴（SARSTEDT，目录号：83.1823.100）
25-mm玻璃盖玻片（Thermo Scientific，Menzel-Gläser，Braunscheig，德国）
6孔板（SARSTEDT，目录号：83.3920）
培养 - 在μ盘中插入2孔35 mm，高度ibiTreat：即可使用（IBIDI，目录号：81176）
无菌独立包装的5毫升移液器（SARSTEDT，目录号：86.1253.001）
0.22μm消毒过滤器（SARSTEDT，目录号：83.1826.001）
20ml注射器（B.Braun Medical，目录号：4617207V-02）
50毫升康宁管（SARSTEDT，目录号：62.547.254）
15毫升锥形管（SARSTEDT，目录号：62.554.502）
来自牙髓的人类间充质干细胞
pCT-CD63-RFP慢病毒载体（System Biosciences，目录号：CYTO120R-VA-1）
HEK293T细胞
用于分析的绝对乙醇（Merck，目录号：1009832500）
台盼蓝（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15250061）
胰蛋白酶/ EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15400054）
DMEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：31885023）
加热灭活的FBS（胎牛血清）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：12484028）
青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
EGM-2 Bullet Kit（Lonza，目录号：CC-3162）
嘌呤霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P9620）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
氯化钾（KCl）（Merck，目录号：PX1405）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
MSC，HIF-MSC和HEK293T培养基（见食谱）
MSC-CD63-RFP和HIF-MSC-CD63-RFP选择培养基（见食谱）

设备

移液器（Eppendorf）
细胞培养罩（任何品牌）
二类A2型生物安全罩（任何品牌）
离心机（离心机5804R）（Eppendorf，型号：5804 R）
Leica TCS SP2 AOBS倒置激光扫描共聚焦显微镜（Leica Microsystems，Heidelberg GmbH，Mnnheim，德国， http：// www。 leica-microsystems.com ）
加热设备

软件

LAS X与FRAP向导
ImageJ（ https://imagej.softonic.com/descargar?ex=DSK-309.1）

程序

在下面描述的方案中，我们分析了来自MSC的外来体的转移，有无HIF-1α的稳定表达对HUVEC的转移。

生产MSC和HIF-MSC
用编码HIF-1α的慢病毒载体和称为pWPI-HIF-1α-GFP的绿色荧光蛋白（GFP）或对照载体pWPI-GFP（ https://www.addgene.org/ ），如前所述（Ciria et。，2017）。
生产MSC-CD63-RFP和HIF-MSC-CD63-RFP
1. 逆转录病毒颗粒获自用表达与四跨膜蛋白CD63：pCT-CD63-RFP（CYTO120R-PA-1）融合的表达红色荧光蛋白（RFP）的载体转导的HEK293T包装细胞系的上清液。
2. 用逆转录病毒颗粒通过0.45微米过滤器过滤上清液。
3. 滴定慢病毒上清液是在新鲜的HEK293T细胞中用本地的病毒载体生产单元（ http://inbiomed.org ）进行的。
4. 在MSC或HIF-MSC培养基中，以5个细胞/ cm 2的新接种的MSC和HIF-MSC以10的感染复数转导8小时。
5. 此后，洗掉含有慢病毒颗粒的培养基，并用新鲜培养基替换
6. 重复这个程序（步骤A5）每天3天。
7. 用嘌呤霉素选择含有pCT-CD63-RFP载体的MSC和HIF-MSC。在含有4μg/ ml嘌呤霉素的MSC培养基中培养细胞24小时。在此之后，洗掉嘌呤霉素，并用新鲜的培养基更换。
8. 使用流式细胞术评估MSC和HIF-MSC中的转导效率（细胞应该是GFP和RFP阳性的）。选择后，转导人群的纯度通常高于90％。
MSC或HIF-MSC与HUVEC的共培养（图1A）
1. 通过在70％乙醇中浸泡5分钟消毒25毫米玻璃盖玻片。
2. 在细胞培养罩中风干盖玻片10分钟，然后放入9cm2的孔中。
3. 在共培养物中或者分别在25孔板上接种总共15×10 3 MSC-CD63-RFP或HIF-MSC-CD63-RFP细胞和10 5 HUVEC，毫米消毒玻璃盖玻片。共培养基是HUVEC和MSC生长培养基的1：1混合物。
  
  图1.共同培养计划：一种。将HUVEC和MSC或HIF-MSC共同培养到盖玻片上; B.将共同培养的蒙太奇镜头盖到实时成像室。
FRAP
1. 共培养24小时后，通过0.22μm过滤器过滤条件培养基以除去细胞碎片和大的EV，然后将过滤的培养基重新加入到相同的孔中。 tetraspanin CD63大部分集中在外泌体中;但是，也有包含CD63的各种尺寸的电动车。因此，为了减少除外泌体以外的囊泡的存在，通过在培养24小时后对培养基进行大小过滤来进行选择。
2. 在实时成像室中进行共培养，共焦显微镜观察（图1B）。由于HUVEC不被荧光标记，所以在这些细胞中红色荧光的检测只能通过掺入从MSC-CD63-RFP和发出绿色和红色荧光的HIF-MSC-CD63-RFP细胞分泌的红色纳米囊泡而产生。
3. 如冈萨雷斯 - 金（Gonzalez-King）等人，2017所述，用460-480nm激光对单个HUVEC进行光漂白。值得注意的是，必须为每种细胞类型和荧光使用的分子。
4. 始终在单元格的同一个“z”平面上拍摄图像。因此，建议在开始图像之前，确保红色荧光（由于共培养24小时期间的红色荧光外泌体摄取）不再存在。要做到这一点，成像之前，检查在不同的'z'平面photobleached细胞。
5. 在单个HUVEC的光漂白之后，使用40x Plan-Apochromat-Lambda Blue 1.4 NA油物镜获得尺寸为1,024×1,024个像素和Airy 1针孔直径的二维伪彩色图像（255个颜色等级）在3小时期间以10分钟的间隔。荧光染料的激发波长为488nm（氩激光）用于检测GFP荧光，而激发波长为561nm（DPSS激光）用于检测DsRed。为避免变化，图像必须在实验开始时建立的相同条件下进行。在分析过程中，使用供应有95％空气/ 5％CO 2湿润气体混合物的加热装置在37℃下保持载玻片。

数据分析

使用ImageJ进行荧光恢复分析。为此，从光漂白前后的图像中，仅从光漂白的HUVEC内测量感兴趣区域（ROI）的红/绿色复合荧光图像（没有透射光图像），并且从光漂白后的每个图像3 h，如图2所示。

图2.用ImageJ测量ROI的荧光强度。：一种。打开ImageJ并选择多边形选择选项。 B.选择已经光漂白的细胞的红色荧光区域。 C.选择分析和测量以给出ROI荧光的数值。

为了测量荧光恢复，100％的荧光恢复被认为是光漂白之前成像的HUVEC的荧光强度。将光漂白后的HUVEC第一图像的荧光强度视为残留荧光的百分比。随后，测量在漂白后3小时内捕获的图像的荧光强度，并表示为在漂白HUVEC之前图像恢复的百分比（图3）。

图3.与MSC-CD63-红色荧光蛋白（RFP）或HIF-MSC-CD63-RFP细胞共培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中光漂白后荧光的恢复。：一种。白色圆圈，光漂白细胞;漂白0和180分钟后的箭头，光漂白细胞;光漂白后的预荧光恢复（FRAP），光漂白之前的细胞的共焦图像; T0'，时间0'处光漂白后的细胞的共焦图像; T180'，光漂白后180分钟的共聚焦图像。以40倍放大率拍摄图像。 B.在漂白后，用MSC-CD63-RFP细胞（黑色标线）或HIF-MSC-CD63-RFP细胞（灰色标线）培养后在0,90和180时间点漂白的HUVEC的荧光回收率的百分比。结果以T0'表示。 **， 0.01; ***， P ＆lt; 0.001。（缩写：FRAP，光漂白后的荧光恢复; HIF，缺氧诱导因子; HIF-MSC，过度表达HIF-1α的间充质干细胞; MSC，间充质干细胞）。
图1所示实例中的结果显示，与HIF-MSC共培养3小时后，与MSC相比，红色荧光恢复的百分比更高。这一发现表明，外来体从HIF-MSC转移到HUVEC比在使用MSC的共培养物中更高。

笔记

在这项工作中，我们分析了来自一种细胞类型的外来体转移，经受或不经受过量表达的HIF-1α，共同培养的另一种细胞类型。该协议应适用于分析其他细胞类型的外来体转移;但是，每种情况下都应确定实验的正确条件。

食谱

MSC，HIF-MSC和HEK293T培养基
含10％热灭活FBS和5％青霉素/链霉素的DMEM
HUVEC培养基为EGM-2 Bullet Kit
MSC-CD63-RFP和HIF-MSC-CD63-RFP选择培养基
加10％热灭活FBS，5％青霉素/链霉素和4μg/ ml嘌呤霉素的DMEM

致谢

这项工作部分得到卡洛斯三世研究所（PI16 / 00107，DTS15 / 00079，DTS17 / 0067），RETICS RD16 / 0011/0004向由FEDER'una manera de hacer Europa'共同出资的PS的资助。它还得到卡洛斯三世研究所再生医学方案和巴伦西亚共同体调查中心费利佩中心的支持。 H. G-K承认与Hecatos项目（FP7-HEALTH-2013-INNOVATION）有关的博士后研究金。这项工作已经发表在干细胞中，该协议第一次被使用（Gonzalez-King et。，2017）。作者声明不存在利益冲突。

参考

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