材料和试剂

兔肌肉G-肌动蛋白（Cytoskeleton，目录号：AKL95-C）
重组Clec9A胞外域通过亲和层析和大小排阻层析如前所述5表达和纯化。
Tris
CaCl <2>
ATP
β-巯基乙醇
KCl
MgCl 2
NuPAGE Novex 4-12％Bis-Tris凝胶（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：NP0327BOX）
Laemmli还原SDS-PAGE样品缓冲液（Laemmli 2x浓缩物）（Sigma-Aldrich，目录号：S3401）
Precision Plus蛋白分子量标记（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0373）
考马斯亮蓝色
1x G缓冲区（请参阅配方）
10x F缓冲区（请参阅配方）

设备

Superdex S200 10/300GL柱（GE Healthcare）
AKTA快速蛋白质液相色谱（FPLC）系统（GE Healthcare）
TLA 100转子和Beckman Coulter Optima TL超速离心机（Beckman Coulter）
聚碳酸酯离心管（7×20mm，230μl）（Beckman Coulter，目录号：343775）
GS-800校准密度计和Quantity一图像分析软件（透射光密度计）（Bio-Rad Laboratories，目录号：1707980）

程序

肌动蛋白的制备
1. 重构小瓶的兔肌肉G-肌动蛋白水溶液（2mg/ml）的冻干粉末，并在室温（RT）孵育蛋白质1/2小时。
  注意：如果组成大量的肌动蛋白，将小型单次使用的等分试样冷冻在-80°C。
2. 用至少35ml的G缓冲液预平衡Superdex S200 10/300 GL柱。
  注意：G-buffer既用作预洗脱，也用作洗脱缓冲液。
3. 加载0.5毫升肌动蛋白（2毫克/毫升）到Superdex S200，并在G缓冲液中以0.5毫升/分钟的流速运行柱子，收集对应于12-15毫升的洗脱体积的柱级分用于分析。
4. 通过在还原条件下的NuPAGE Novex 4-12％Bis-Tris凝胶上的SDS-PAGE分析反映肌动蛋白峰（G-肌动蛋白分子量为42-43kDa）的级分，并通过考马斯亮蓝染色观察蛋白质以确认纯度的G-肌动蛋白
5. 反映G-肌动蛋白峰的泳池部分。
6. 通过加入1/10体积的10×F-缓冲液并在室温下孵育1小时，将G-肌动蛋白（来自步骤1e的合并的单体G-肌动蛋白）聚合成F-肌动蛋白。
测定肌动蛋白丝结合
1. 使用在步骤A-6中产生的肌动蛋白丝在一系列浓度的肌动蛋白丝（0,1,2,5μM）的聚碳酸酯超速离心管中建立一系列反应管，并添加固定量的潜在的肌动蛋白相互作用蛋白质（Clec9A;5μM）或不与肌动蛋白（5μM）相互作用的对照蛋白质，总体积为50μl。作为对照，还包括单独的1管肌动蛋白。
  注意：用于每个反应的肌动蛋白丝的浓度应基于步骤A-5中G-肌动蛋白的初始浓度。
2. 在室温下孵育反应1小时
3. 通过使用固定角转子在RT下超速离心100,000小时沉淀肌动蛋白丝和相关蛋白1小时。
4. 将上清液转移到新管中
5. 通过加入50μl1×F缓冲液（稀释于G缓冲液中）并沉淀肌动蛋白丝和相关蛋白质，通过在100,000xg下超速离心1小时在RT下洗涤沉淀物。
6. 去除上清液，并在1×Laemmli还原SDS-PAGE样品缓冲液（与上清液等体积）中重悬沉淀
7. 对于肌动蛋白+/-肌动蛋白的每个反应，设置含有等体积的上清液（来自步骤B-4）的管，用SDS-PAGE样品缓冲液或重悬浮的沉淀在SDS-PAGE样品缓冲液（来自步骤B-6）结合蛋白，然后在95℃孵育样品5分钟
8. 通过SDS-PAGE分析样品，通过考马斯亮蓝染色观察蛋白质
9. 通过使用GS-800校准密度计的光密度测定分析定量上清液和沉淀部分中的Clec9A的量。
  注意：重要的是要注意，当样品在还原条件下进行分析时，条带的大小在SDS-PAGE上不改变。作为F-肌动蛋白沉积的结果，从上清液到沉淀物的条带的变化有什么变化。
10. 计算沉淀中Clec9A条带的强度，以及Clec9A（沉淀+上清液）总量的强度。然后计算与F-肌动蛋白共沉淀的Clec9A的比例作为沉淀中Clec9A相对于总Clec9A（上清液+沉淀中的Clec9A）的比例，即沉淀中Clec9A的强度除以Clec9A的强度（上清液+沉淀）。 Clec9A与F-肌动蛋白共沉淀的比例相对于非特异性结合对照被解释为与F-肌动蛋白的特异性结合。

食谱

1x G缓冲区
20mM Tris（pH8）
0.1mM CaCl 2/v/v 0.1 mM ATP
5mMβ-巯基乙醇
10x F缓冲区
1 M KCl
20 mM ATP
20mM MgCl 2/

致谢

张建国获澳大利亚政府NHMRC计划拨款461219和1016647支持。他的工作还通过维多利亚州政府运营基础设施支持和澳大利亚政府NHMRC IRIISS实现。

参考文献

Ahrens，S.，Zelenay，S.，Sancho，D.，Hanc，P.，Kjaer，S.，Feest， Fletcher，G.，Durkin，C.，Postigo，A.，Skehel，M.，Batista， Thompson，B.，Way，M.，Reis e Sousa，C。和Schulz，O。（2012）。 F-肌动蛋白是由DNGR-1识别的进化上保守的损伤相关分子模式，受体死细胞。免疫 36（4）：635-645。
Mehta，S。和Sibley，L.D。（2010）。弓形体弓形体肌动蛋白解聚因子主要用于隔离G-肌动蛋白。 Biol Chem 285（9）：6835-6847。
Schuler，H.，Mueller，A.K.and Matuschewski，K。（2005）。疟原虫肌动蛋白解聚因子，仅与肌动蛋白单体结合。 Biol Cell 16（9）：4013-4023。
Singh，B.K.，Sattler，J.M.，Chatterjee，M.，Huttu，J.，Schuler，H。和Kursula，I。（2011）。晶体结构解释了疟原虫两种肌动蛋白解聚因子的功能差异。 em> J Biol Chem 286（32）：28256-28264。
Srivastava，J。和Barber，D。（2008）。肌动蛋白共沉淀测定; 用于分析蛋白质与F-肌动蛋白的结合。
（13）。
Zhang，JG，Czabotar，PE，Policheni，AN，Caminschi，I.，Wan，SS，Kitsoulis，S.，Tullett，KM，Robin，AY，Brammananth，R.，van Delft，MF，Lu，这些研究结果表明，这些研究结果表明，该方法能够有效地降低患者的生活质量，提高患者的生活质量， RL，Colman，PM，Nicola，NA，Shortman，K。和Lahoud，MH（2012）。树突状细胞受体Clec9A通过暴露的肌动蛋白丝结合受损细胞。免疫 36（4）：646-657。