材料和试剂

移液器吸头
1. 0.1-10μl容量（USA Scientific，目录号：1111-3700）
2. 1-200μl容量（VWR，目录号：89079-474）
3. 容量100-1,250μl（VWR，目录号：53508-924）
PCR 8孔管条（VWR，目录号：20170-004）
50毫升离心管（VWR，目录号：89039-660）
1.7 ml微量离心管（MIDSCI，目录号：AVSS1700）
纯化的呼肠孤病毒储液（参见[Berard and Coombs，2009; Kobayashi et al。，2010]，用于繁殖和纯化过程）
碎冰
标准SDS-PAGE材料和试剂（例如，10％SDS-聚丙烯酰胺微型凝胶）
考马斯亮蓝染色和脱色溶液（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610435）
漂白剂（Biz4USA，Janitorial Supplies，目录号：CLO30966CT）
2-氨基-2-（羟甲基）-1,3-丙二醇（Tris）（MP Biomedicals，目录号：02103133）
氯化镁六水合物（MgCl 2•6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M9272）
氯化钠（NaCl）（Merck，目录号：SX0420-3）
0.1N盐酸（Sigma-Aldrich，目录号：2104）
N氢氧化钠（Sigma-Aldrich，目录号：2105）
4×Laemmli样品缓冲液（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610747）
N-α-甲苯磺酰-L-赖氨酸氯甲基酮（TLCK）处理的胰凝乳蛋白酶（Worthington Biochemical，目录号：LS001432）
胰蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：T6567）
苯基甲基磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
超纯脱氧核糖核酸酶/无RNA酶的蒸馏水（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：10977015）
异丙醇（Avantor Performance Materials，Macron，目录号：3032-02）
50％的漂白剂（见食谱）
病毒存储缓冲区（VB）（请参阅食谱）
2毫克/毫升α-对甲苯磺酰-L-赖氨酸氯甲基酮（TLCK）处理的胰凝乳蛋白酶（参见食谱）
100毫米苯甲基磺酰氟（PMSF）（见食谱）
1毫克/毫升胰蛋白酶（见食谱）

设备

个人防护设备（PPE）
1. 实验室外套
2. 手套
3. 眼睛保护
生物安全2级（BSL-2）实验室设施
BSL-2认证的组织培养罩
固体和液体废物容器
高压灭菌器
冰桶
-20°C冷冻机
微量移液器
1. 0.1-2.5μl容量（Eppendorf，目录号：3123000012）
2. 2-20μl容量（Eppendorf，目录号：3123000039）
3. 20-200μl容量（Eppendorf，目录号：3123000055）
4. 100-1,000μl容量（Eppendorf，目录号：3123000063）
数字pH计（VWR，型号：SB70P）
数字实验室天平（梅特勒 - 托利多，型号：PB1502-S）
NanoDrop分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：ND-1000）
热板搅拌器（VWR，目录号：12365-382）
磁力搅拌棒（VWR，目录号：58948-273）
热循环仪（Bio-Rad Laboratories，型号：S1000 TM）
模拟干式加热器（VWR，目录号：12621-110）
温度计（VWR，目录号：89095-566）
凝胶成像系统（LI-COR，型号：Odyssey®Classic）
1000毫升玻璃烧杯（VWR，目录号：89000-212）
1000毫升量筒（VWR，目录号：65000-012）
1000毫升储存瓶（VWR，目录号：89000-240）
注：此产品已停产。

软件

Image Studio Lite（LI-COR）

程序

产生感染性亚病毒颗粒（ISVPs）
1. 如先前所述（Berard和Coombs，2009; Kobayashi等人，2010）繁殖和纯化呼肠孤病毒毒粒。使用NanoDrop分光光度计，通过测量纯化的病毒原液在260nm处的光密度（OD 260 = 1，OD 260 = 2.1×10 -1， > 12颗粒/ ml）（Smith等人，1969）。
2. 在8孔管条的1根管中，将2×10 11病毒体稀释到90μl冰冷的VB中（见食谱）。
3. 加10μl冰冷的2mg / ml TLCK处理的胰凝乳蛋白酶（见食谱）到稀释的病毒中。
  上下移液3-4次注意：对于未消化的对照，用10μl冰冷的VB取代10μlTLCK处理的胰凝乳蛋白酶。
4. 在32°C的热循环仪孵育反应20分钟注意：在这些条件下，σ3被降解（Joklik，1972; Borsa等，1973a），而μ1被裂解（Nibert和Fields，1992; Chandran等，1999）。 >
5. 消化后，通过加入1μl100mM PMSF淬灭糜蛋白酶活性（参见食谱）。
  上下移液3-4次
6. 在冰上孵育反应20分钟
7. 为确认产生了ISVP，在10％SDS-聚丙烯酰胺微型凝胶上每泳道运行2×10 10个颗粒。
  在200V恒定温度下运行凝胶40-45分钟
8. 通过考马斯亮蓝染色显示蛋白质条带（见数据分析，图1）。
9. 将ISVP储存在冰上，2-3小时内用于ISVP-to-ISVP *转换实验。
ISVP到ISVP *转换测定
1. 加入10μlISVPs到8孔管冰上的每个管
2. 在热循环仪中以温度梯度孵育ISVPs 1小时（即，每管在不同的温度下孵育）。
  注：适当的温度范围将根据孵育时间（5分钟至1小时）和正在研究的呼肠孤病毒菌株而变化。温度梯度的每一步应不低于1°C。 ISVP到ISVP *的转换通常发生在30°C和50°C之间。
3. 在冰上培养热处理ISVPs5分钟
4. 加入0.9微升1毫克/毫升胰蛋白酶（见食谱），每管热处理ISVPs。
  上下移液3-4次
5. 在冰上孵育反应30分钟
注意：由于ISVP到ISVP *的转换，μ1的中心δ片段采用蛋白酶敏感构象（Chandran et al。，2002）。
1. 消化后，加入3.3微升4×Laemmli样品缓冲液到每个反应。
  上下移液3-4次
2. 每个反应煮沸5分钟在95°C
3. 为了确定ISVP到ISVP *转换发生的温度，运行2×10 10个颗粒（ ie ，整个ISVP到ISVP *转换反应在给定温度）在10％SDS-聚丙烯酰胺微型凝胶上进行。
  在200V恒定温度下运行凝胶40-45分钟
4. 通过考马斯亮蓝染色显示蛋白质条带（见数据分析，图2）。

数据分析

产生感染性亚病毒颗粒（ISVPs）
1. 使用凝胶成像系统和Image Studio Lite软件记录和分析结果（图1）。
  1. 病毒体含有λ1,2,3，μ1C，σ2和σ3。
  2. ISVPs包含λ1,2,3，μ1C，δ和σ2。
  注意：δ的出现，μ1C的损失以及σ3的损失表明从病毒粒子到ISVP的转变。 λ1,2,3和σ2应保持不变。
  
  图1.呼肠孤病毒和ISVPs的SDS-PAGE凝胶
2. ISVP到ISVP *转换测定
  1. 所有的ISVP-ISVP *实验都应该重复进行至少三次独立的重复。
  2. 使用凝胶成像系统和Image Studio Lite软件记录和分析结果（图2）。
    1. 胰蛋白酶处理的ISVPs含有λ1,2,3，μ1C，δ和σ2。
    2. 胰蛋白酶处理的ISVP * s含有λ1,2,3和σ2。
  注意：μ1C和δ的损失表明从ISV到ISVP的转换。 λ1,2,3和σ2应保持不变。
  
  图2.加热和胰蛋白酶处理的呼肠弧病毒ISVPs的SDS-PAGE凝胶在这里显示的实验中，ISVP-to-ISVP *转换发生在44,45和46℃。

笔记

如果可能的话，所有的程序都在BSL-2认证的组织培养罩中进行。
实验室人员应使用适当的PPE。
所有的固体废物都是在处理之前进行高压灭菌。
所有的液体废物在处理之前都用50％的漂白剂灭活。

食谱

50％漂白
在储存瓶中，将50ml 100％漂白剂稀释到50ml超纯H 2 O中
病毒储存缓冲液（VB）（10mM Tris，pH 7.4,15mM MgCl 2和150mM NaCl）
1. 在玻璃烧杯中，将以下成分溶解在900ml超纯H2O2中：
  1.21克Tris
  3.05克MgCl2•6H2O 2 O. 8.77克NaCl
2. 在搅拌盘上使用磁力搅拌棒在室温下混合
3. 用0.1N盐酸调pH至7.4
4. 在一个量筒中，用超纯水将最终体积加到1000ml
5. 将解决方案转移到存储瓶
6. 通过高压灭菌来消毒
7. 在室温下储存
2毫克/毫升α-甲苯磺酰-L-赖氨酸氯甲基酮（TLCK）处理的胰凝乳蛋白酶
1. 在离心管中，将100mg TLCK处理的胰凝乳蛋白酶溶解于50ml超纯H2O2中
2. 在室温下轻轻翻转管，直到溶液变得透明
3. 将1毫升等分试样转移到微量离心管中
4. 在-20°C储存
100毫米苯甲基磺酰氟（PMSF）
1. 在微量离心管中，将17.4mg PMSF溶解在1ml异丙醇中
2. 在室温下轻轻翻转管，直到溶液变得透明
3. 在-20°C储存
1毫克/毫升胰蛋白酶

在微量离心管中，将1mg胰蛋白酶溶解在1ml超纯H 2 O中
在室温下轻轻翻转管，直到溶液变得透明
在-20°C储存

致谢

该协议是从以前发表的研究（Chandran等人，2002年）改编的。在该出版物中报道的研究得到了国立卫生研究院的过敏和传染病研究所的支持，奖项号码分别为1R01AI110637（至P.D.）和F32AI126643（至A.J.S.），印第安纳大学布卢明顿分校。内容完全是作者的责任，不一定代表出资者的官方观点。作者宣称没有利益冲突。

参考

阿冈斯托， M. A.，Myers，K. S.，Ivanovic，T.和Nibert，M.L。（2008）。正反馈机制将呼肠孤病毒颗粒转化为与膜渗透相关的中间体。Proc Natl Acad Sci U S A 105（30）： 10571-10576。
贝尔， G. S.和 Dermody，T. S.（1997）。突变在持续感染期间选择的呼肠孤病毒外壳蛋白sigma3中的L细胞赋予对蛋白酶抑制剂E64的抗性。 J Virol 71（7）：4921-4928。
贝拉尔， A.和Coombs，K.M。（2009）。哺乳动物呼肠孤病毒：传播，定量和储存。 Protr Microbiol 第15章： Unit15C 11。
证交所， J.，Copps，T.P.，Sargent，M.D.，Long，D.G。和Chapman，J.D。（1973a）。新在中的中间亚病毒颗粒通过糜蛋白酶对呼肠孤病毒毒粒进行体外脱壳。 J Virol 11（4）：552-564。
证交所， J.，Morash，B.D.Sargent，M.D。，Copps，T.P.，Lievaart，P.A。和Szekely， J.G.（1979）。两呼肠孤病毒颗粒进入L细胞的模式.Ju Gen Virol 45（1）：161-170。
证交所， J.，Sargent，M. D.，Lievaart，P.A。和Copps，T.P.（1981）。呼肠孤病毒：细胞内脱衣的第二步的证据和转录酶激活过程。病毒学 111（1）：191-200。
证交所， J.，Sargent，M.D。，Long，D.G。和Chapman，J.D。（1973b）。非凡特定单价阳离子对呼肠孤病毒转录酶活化的影响 by chymotrypsin in vitro 。 J Virol 11（2）：207-217。
德兰， K.，Farsetta，D.L。和Nibert，M.L。（2002）。策略对于无包膜病毒进入：呼肠孤病毒膜的疏水性构象穿透蛋白micro 1介导膜破坏。 J Virol 76（19）：9920-9933。
德兰， K.，Walker，S.B。，Chen，Y.，Contreras，C.M.，Schiff，L.A.，Baker，T.S。和 Nibert，M.L。（1999）。体外重涂呼肠孤病毒核心与杆状病毒表达的外壳蛋白mu1和 sigma3。 Virol 73（5）：3941-3950。
张， C. T.和 Zweerink，H.J。（1971）。父母呼肠孤病毒的命运在感染的细胞。病毒学 46（3）：544-555。
Dermody， T. S.，Nibert，M. L.，Wetzel，J. D.，Tong，X。和Fields，B.N。（1993）。在持续感染L期间选择具有影响病毒进入的突变的细胞和病毒细胞与哺乳动物呼肠孤病毒。 J Virol 67（4）：2055-2063。
Dermody，T. S.，Parker，J. S. L.和Sherry，B。（2013）。 Orthoreoviruses。在：Knipe，D.M。和Howley，P.M。（编辑）中。 Fields Virology 6th edn。利平科特威廉斯＆amp; Wilkins ：1304-1346。
德莱顿， K. A.，Wang，G.，Yeager，M.，Nibert，M. L.，Coombs，K. M.，Furlong，D. B.， Fields，B.N。和Baker，T.S.（1993）。早期呼肠孤病毒感染的步骤是相关的具有超分子结构和蛋白质构象的巨大变化：通过冷冻电子显微镜和图像分析病毒颗粒和亚病毒颗粒重建 Cell Biol 122（5）：1023-1041。
艾伯特， D. H.，Deussing，J.，Peters，C。和Dermody，T. S.（2002）。组织蛋白酶L和组织蛋白酶B在小鼠中介导呼肠孤病毒分解成纤维细胞生物化学杂志277（27）：24609-24617。
埃利希 M.，Boll，W.，Van Oijen，A.，Hariharan，R.，Chandran，K.，Nibert，M.L。和 Kirchhausen，T。（2004）。通过随机的内分泌学方式起始和稳定网格蛋白包被的小窝。细胞 118（5）：591-605。
Joklik， W. K.（1972）。研究的影响糜蛋白酶对再生病毒的作用。病毒学 49（3）：700-715。
小林 T.，Ooms，L.S.，Ikizler，M.，Chappell，J.D。和Dermody，T.S。（2010）。改进的哺乳动物逆转录病毒的反向遗传学系统病毒学 398（2）： 194-200。
Maginnis， M.S.，Forrest，J.C.，Kopecky-Bromberg，S.A。，Dickeson，S.K。，Santoro，S。 A.，Zutter，M.M.，Nemerow，G.R.，Bergelson，J.M。和Dermody，T.S。（2006）。 β1整合素介导哺乳动物呼肠孤病毒的内在化 Virol 80（6）： 2760年至2770年。
Maginnis， M.S.，Mainou，B.A.，Derdowski，A.，Johnson，E.M.，Zent，R.and Dermody，T. S.（2008）。 NPXY 在beta1整合素胞质尾部的基序是需要进行功能性呼肠孤病毒进入。 J Virol 82（7）：3181-3191。
米德尔顿， J. K.，Severson，T. F.，Chandran，K.，Gillian，A.L.，Yin，J。和Nibert，M.L。（2002年）。热稳定性呼肠孤病毒分解中间体（ISVPs）与遗传，主要表面蛋白mu1的生物化学和热力学性质。“病毒学杂志”76（3）：1051-1061。
尼贝尔， M.L.和M. Fields，B.N。（1992）。 A 蛋白质mu 1 / mu 1C的羧基端片段存在于哺乳动物呼肠孤病毒的感染性亚病毒颗粒中被提议在渗透中起作用。 J Virol 66（11）：6408-6418。
萨卡， P.和Danthi，P。（2010）。应变特异性的决定因素呼肠孤病毒进入效率的差异。 Virol 84（24）：12723-12732。
西尔弗斯坦， S.C.，Astell，C.，Levin，D.H。，Schonberg，M。和Acs，G。（1972）。体内呼肠孤病毒和基因激活的机制。病毒学 47（3）：797-806。
史密斯， R.E.，Zweerink，H.J。和Joklik，W.K。（1969）。多肽病毒组分，呼肠孤病毒3型的顶部成分和核心。病毒学 39（4）：791-810。
斯奈德 A.J.和A. Danthi，P。（2015）。脂质膜促进呼肠弧病毒进入细胞所需的构象变化。 Virol 90（5）：2628-2638。
斯奈德 A.J.和A. Danthi，P。（2016）。脂质配合呼肠孤病毒穿膜肽促进颗粒不涂层 Biol Chem 291（52）：26773-26785。
Sturzenbecker， L.J.，Nibert，M.，Furlong，D。和Fields，B.N。（1987）。呼肠孤病毒颗粒的细胞内消化需要较低的pH值，这是病毒感染周期中的重要步骤。 J Virol 61（8）：2351-2361。
张， X.，Ji，Y.，Zhang，L.，Harrison，S.C。，Marinescu，D.C.，Nibert，M.L。和 Baker，T. S.（2005）。特点呼肠孤病毒外壳蛋白mu1的电子冷冻显微镜和透射电镜观察以7.0埃的分辨率对病毒体进行图像重建。 Structure 13（10）：1545-1557。