材料和试剂

注意：由于硼从实验室玻璃器皿中渗出，所有化学品都应该用塑料瓶包装。

猎鹰管（15毫升和50毫升）（SARSTEDT，目录号：62.547.254）
1.5毫升管
移液器提示
96孔UV微孔板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：8404）
硼酸（H 3 BO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：15663）
0.1 N盐酸（HCl）
2-乙基-1,3-己二醇（Acros Organics，目录号：118512500）
氯仿（Fisher Scientific，目录号：10122190）
浓硫酸（H 2 SO 4）（Fisher Scientific，目录号：10294300）
浓缩乙酸（Fisher Scientific，目录号：10304980）
姜黄素（Alfa Aesar，产品目录号：B21573）
甲基异丁基酮（MIBK）（Avantor Performance Materials，MACRON，目录号：6247-04）
提取解决方案（见食谱）
酸混合物（见食谱）
姜黄素溶液（见食谱）

设备

离心机
化学通风橱
移液器
酶标仪（BMG LABTECH，型号：CLARIOstar）

程序

通过在4,000×g（对于酵母）/ 100×g（对于原生质体）中离心5分钟，将酵母/原生质体样品收获在50ml Falcon管中。用25毫升冰冷的水清洗沉淀，以去除沉淀中的硼酸。在一个1.5毫升的管中重悬在400微升Milli-Q水中的沉淀。将样品在90℃加热30分钟并涡旋以将细胞内B释放到溶液中。在室温下以最大速度离心2分钟并收集300μl上清液用于B定量。
对于酵母中的详细的硼摄取测定，用户可以参考Takano et al。，2002;并处理来自植物组织的原生质体，请参阅Yoo et al。，2007。
注意：如果用户不使用水溶解样品，我们建议用户使用自己的缓冲液/溶剂进行测试。
准备含有0,0.02,0.05,0.10,0.19,0.39,0.77mg硼酸/ L的标准品，使用Milli-Q水在15ml Falcon管中（参见表1）。

的表1。硼酸标准不同单位
将300μl（相当于0.1,0.2,0.5,0.9,1.9,3.7nmole B）的各标准品和样品分装到1.5ml管中。
通过加入100μl0.1N HCl酸化样品和标准品。通过涡旋混匀，室温孵育5分钟。
注意：从第3步开始，在化学通风柜中进行所有的反应。
加入70μl提取液（见食谱），剧烈搅拌30秒。 2分钟后，重复旋涡30秒。
将样品以15,000×g的速度离心5分钟以促进有机相的清晰分离。
吸取50μL较低的有机相（图1A）到一个新的1.5毫升含200μl酸混合物的管中（见食谱），并通过涡旋混匀。
注意：
1. 请注意，较低的相含有氯仿，氯仿会从塑料吸头漏出。为避免吸移误差，请确保吸头紧密连接到移液器并快速转移液体。
2. 硫酸和乙酸的混合物是粘性溶液。因此，在移液过程中必须小心，以避免由于腐蚀性的解决方案而导致的吸液错误和对使用者的危害。我们建议切割1毫升尖端的尖端，并在通风橱中慢慢吸取。
图1.在硼不存在（-B）或存在（+ B）的情况下，显示相分离和颜色发展的步骤
加250μL姜黄素溶液（见食谱），摇匀，直到形成均匀的深紫色（图1B）。
在15,000×gg离心管1分钟，并将反应混合物在室温下孵育1小时。
1小时后，加入500微升Milli-Q水，停止反应，并倒置管混匀。
15,000×g g离心管1分钟，以促进清晰的相分离。
小心吸取200μL的上层相（图1C）到96-孔紫外微孔板中，并使用酶标仪在550nm处测量吸光度。
注意：反应混合物中的氯仿溶解许多类型的塑料微孔板并干扰吸光度读数。因此，使用耐有机溶剂的微孔板是非常重要的（例如Thermo Scientific TM 96孔UV微孔板或石英微孔板）。
绘制吸光度与B的量的关系曲线，并如图2所示制备校准曲线。为了获得校准曲线，使用相对于硼量（nmole B）的吸光度值（A505nm）绘图一个电子表格（图2的左图）。
注：詹宁斯等人，2007年使用姜黄素法和ICP-MS来量化酵母细胞中的硼。他们发现使用这两种方法的结果是难以区分的。

图2.用于测定硼浓度的校准曲线。在550nm测量的吸光度（A505nm）。
使用获得的校准曲线来确定未知样品中的B的数量。

食谱

注意：每次在猎鹰管中制作新鲜的解决方案。

提取解决方案
将2-乙基-1,3-己二醇10％（v / v）溶于氯仿中
酸混合物
在Falcon管中以1：1（v / v）的比例混合硫酸（浓）和乙酸（浓）
姜黄素溶液
将姜黄素（2毫克/毫升）粉末溶于MIBK（甲基异丁基酮）

致谢

本议定书改编自Wimmer和Goldbach（1999）的原始论文。这项工作得到了英国生物技术和生物科学研究委员会（BBSRC）的资助（BB / N017765 / 1）的支持。作者声明不存在利益冲突。

参考

Bingham，F. T.（1982）。硼。在：Page，A.L。（编）。土壤分析方法第2部分化学和矿物学性质 < 美国农艺学会 pp：431-448。
Jennings，M.L.，Howren，T.R。，Cui，J.，Winters，M。和Hannigan，R。（2007）。酵母碳酸氢盐转运蛋白同系物Bor1p的运输和调控特征 Am J Physiol Cell Physiol 293（1）：C468-76。
Kmiecik，E.，Tomaszewska，B.，Wator，K.和Bodzek，M.（2016）。在水处理过程中选定的硼测定问题。第一部分：比较ICP-MS和ICP-OES测定的参考方法。

环境科学Pollut Res Int 23（12）：11658-11667。
Takano，J.，Noguchi，K.，Yasumori，M.，Kobayashi，M.，Gajdos，Z.，Miwa，K.，Hayashi，H.，Yoneyama，T。和Fujiwara，T。（2002）。拟南芥用于木质部负载的硼转运蛋白自然 420（6913）：337-40。
Yoo，S.D。，Cho，Y.H。和Sheen，J。（2007）。拟南芥叶肉原生质体：用于瞬时基因表达分析的多功能细胞系统。

Nat Protoc 2（7）：1565-72。
Wimmer，M.A。和Goldbach，H.E。（1999）。（a）（a） “目标=”_ blank“>微型姜黄素测定溶液和生物样品中硼的方法。 J植物营养土壤科学 162：15-18。