材料和试剂

圆形玻璃盖玻片25 mm 1.5号（Kindler / ORSA tec ®，圆形眼镜）
6孔板（Corning，Costar ®，目录号：3516）
猎鹰管（15毫升）（VWR，康宁，目录号：62406-200）
血清学移液器（Corning，Costar ，目录号：4488）
质粒
mitoHyPer（Evrogen，目录号：FP942）
mitoSypHer（Addgene，目录号：48251）
细胞生长培养基（特异于实验中使用的细胞）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10270106）
Fugene HD（Promega，目录号：E2312）
Opti-MEM TM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：51985-026）。
Baysilone粘贴（GE拜耳有机硅，超链接供应商）
Accutase（Sigma-Aldrich，目录号：A6964）或胰蛋白酶（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25300062）
1×DPBS，不含钙，不含镁（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：14190-094）
1,4-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
含有稳定剂（Sigma-Aldrich，目录号：H1009）的H 2 O中的30％（w / w）的过氧化氢溶液。
兴奋剂和抑制剂（这些是依赖于实验的）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
氯化钾（KCl）（VWR，AnalaR NORMAPUR®，目录号：26764.298）
氯化钙二水合物（CaCl 2•2H 2 O）（Merck，目录号：102382）
氯化镁（MgCl 2）（Merck，目录号：105833025）
D（+） - 无水葡萄糖（Merck，目录号：108337）
EGTA（Sigma-Aldrich，目录号：E4378）
1M HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H7523）
林格缓冲液（0.25mM Ca2 +，pH7.4）（见食谱）

设备

Z系列电脑计数器（Beckman Coulter，型号：6605699）和粒子计数器Z1（Beckman Coulter或任何其他计数装置）
培养箱，湿度和气体控制细胞培养
Zeiss Axio Observer.Z1（Carl Zeiss，型号：Axio Observer.Z1）设置（图1）（孵育系统S包括Temp模块S，CO模块S，O 模块S，加热模块S）
镊子（，例如，样式Dumont Nr。7）
成像室和环插入（自制）和灌注系统（图2）

图1. Zeiss Cell Observer.Z1设置温度，CO 2控制单元，气室和灌注系统。：一种。分析电脑; B.具有40x油物镜和相应滤光器组的Cell Observer.Z1; C. Evolve 512 x 512 EM-CCD相机; D. CO 2供应装置; E. Pecon XL S1培养箱和控制模块; F. LED Colibri与相应的模块。 G.泵和灌注系统。
注意：
1. 对于HyPer测量，CFP / YFP滤波器是必不可少的，但具有相同特性的多频带滤波器立方体也是一个功能选项。
2. 对于HyPer实验，我们使用波长为505 nm和420 nm的LED光源和相应的分束器。
  
  图2.带温度控制的成像室和安装模块：一种。自制的成像室（一）与灌注室塑料插入（二），与旋钮固定（三）。带有细胞的盖玻片连接到塑料插入物的下部，并且将12mm的小盖玻片连接到塑料插入物的上部以形成用于测量的小灌注通道。 B.成像室连接到灌注系统和显微镜的阶段（一）。灌注管（ii）连接到注射器上以便在测量过程中添加溶液，而第二灌注管（iii）连接到抽吸泵系统以除去废液。

软件

Axiovision 4.6v（蔡司）具有快速采集功能和测量分析或类似的许可证

程序

第一天：细胞培养和播种
该方案对于粘附细胞是示例性的，其可以用诸如Fugene HD的试剂转染。对于难以转染的细胞系，我们推荐替代转染方法（例如电穿孔核转染）。如果表达所需传感器的稳定细胞是可用的，则它们也可以用于本方案中描述的成像实验。
1. 用相应的生长培养基培养细胞，直到达到约70％的汇合度。取出生长培养基，用5ml DPBS洗涤细胞一次，并在室温下将它们与1ml胰蛋白酶或1ml accutase（用于正常培养）一起温育来分离细胞。
2. 将细胞悬浮在生长培养基中，用DPBS以100μl的比例稀释100μl，总体积为10ml。
  用Z1细胞计数器或血细胞计数器确定稀释液中的细胞浓度
3. 将高压灭菌的玻璃盖玻片置于6孔板中，并在2ml生长培养基中的每个孔中接种400,000个细胞（在本实施例中为HEK293细胞）。将培养板置于加湿细胞培养箱（37℃，5％CO 2）中孵育过夜。
第2天：转染
1. 从冰箱中取出Opti-MEM培养基和Fugene HD溶液，并在室温下平衡几分钟。
2. 将100μlOpti-MEM培养基与4至10μlFugene HD溶液（根据生产商的方案）混合，加入建议量的质粒DNA（1μg/μl无内毒素储备溶液）（推荐1μg/孔，但最佳用量可以不同，取决于细胞类型和质粒）。将混合物上下吸移15次。
  注意：最佳的转染条件，如细胞密度，DNA量，DNA：Fugene HD比率可能需要对细胞进行优化行的选择。
3. 在室温下等待15分钟，然后向每个孔中加入100μl转染混合物。
  注意：
  1. 如果您的细胞生长培养基含有抗生素，建议在转染之前将其改为不含抗生素的生长培养基，因为它们可能降低转染效率;否则，在转染混合物加入之前不需要改变生长培养基。
  2. 由于mitoHyPer和mitoSypHer具有相同的光谱特征，因此应该分别转染（在不同的孔中）。
4. 将细胞在潮湿细胞培养箱（37℃，5％CO 2）中孵育。用新鲜的细胞生长培养基在6小时后改变转染孔中的培养基。将细胞保持在培养箱中，直到准备成像（37℃，5％CO 2），持续约24-48小时。
第3天或第4天：成像
用Zeiss Cell Observer.Z1设置温度，CO 2控制单元，气室和灌注系统（图1）进行成像。
1. 用一对精细的镊子轻轻地去除细胞覆盖的盖玻片（避免在盖玻片的中央成像区域中细胞的报废）。在灌注室塑料插入物（自制）的底部边缘添加Baysilone贴，并将其贴在盖玻片上（细胞朝上）。为了创建一个小的灌注通道，在塑料插入物的上部固定一个带有Baysilone贴的12毫米盖玻片。然后用旋钮固定塑料插入物（盖玻片），并将组装的腔室放入金属成像室（见图2A）。
  注意：如果只进行简单的实验，分析静息水平，然后加入饱和的H，使用标准成像室或玻璃底板可能就足够了，并通过用移液管小心添加试剂来刺激信号变化。但是对于更精确的实验来说，建议使用灌注系统进行多次添加或洗出实验。
2. 将成像室放在显微镜载物台上，并将含有灌注管的溶液（避免系统中的空气）连接到室的相对两侧（如图2B所示）。用2毫升林格溶液（请参阅食谱）轻轻灌洗洗去分离的细胞。等待5分钟以达到CO 2（5％）和温度（37℃）平衡，然后再进行处理。
  注意：CO和温度由成像系统和相应的控制单元控制和监控。我们的灌注系统的一侧有一个注射器，可以手动使用林格溶液，另一侧使用抽吸泵来清除废物。
3. 使用40倍的目标，搜索一个适当的视野，使您可以评估单独的，连接良好的细胞。设置LED强度以获得适当的信号，但不能太高以避免传感器的光漂白。优化曝光时间以获得良好的图像质量（背景上的信号），并将两个通道（420nm对505nm）的曝光时间比保持为所有实验的常数。根据所使用的细胞类型和可用的设备，这部分程序需要一些时间进行优化，因为光源和照相机可能会有所不同。
4. 通过每1秒钟测量细胞中H 2 O 2的静止水平开始实验至少10秒，然后通过灌注系统添加刺激物质并记录直到信号稳定（或根据刺激方案）。应该优化每分钟的帧数和总的成像时间以获得适当的时间分辨率，而且还要避免光漂白。
  注意：根据科学问题和细胞类型，导致线粒体产生ROS的刺激物质是不同的。对于其他科学问题，只有静息的氧化还原水平（例如正常情况下的生理浓度）可能是有意义的。 >
5. 在每次测量结束时，应加入单剂量的饱和H 2 O 2（例如1mM）作为阳性对照并确定传感器的最大强度（这可能需要校准系统）。为了检测完全减少的传感器的荧光强度（这将指示传感器在静息条件下是否已经被氧化并提供最小值用于校准），我们建议添加还原剂（例如，2mM DTT）在实验结束。
6. 使用mitoSypHer传感器作为成像控制执行相同的成像过程，因为HyPer传感器可能会受到pH变化的影响。
  注意：如果使用HyPer传感器进行实验期间获得的信号（或比率变化）是由于氧化造成的，则在相同的实验条件下，SypHer信号不会发生任何变化。如果pH影响你的结果，你也会看到SypHer传感器的比例的变化。由于HyPer是一个pH依赖型传感器，为了讨论有关氧化还原变化的数据，这种控制是强制性的。

数据分析

使用Axiovision软件进行分析

背景更正
应该通过从目标（基于单元的）ROI减去背景ROI中的强度值来执行背景校正（图3）。

图3.表达mitoHyPer的HEK293细胞的分析实例（也参见图4）A.合并的图像（420nm绿色，505nm红色）。 B.分析的示例性介绍。红色圆圈表示无细胞区域的背景ROI，而一些细胞的边界用白色徒手绘制的ROI标记进行分析。
比率分析
比例动力学曲线是用下面的公式生成的：

使用Axiovision软件。
注意：数据分析可以使用来自其他供应商的不同软件来执行。 HyPer比率的基本计算也可以使用开源软件来完成，例如ImageJ（ https ：//imagej.nih.gov ）。
数据通常以平均值±SEM（或SD）表示，并用双侧Student's检验显着性。对于每个条件，至少有三个实验应该进行适当的重复。
以下是代表性图像（A），放大单细胞（B），图表总结（C）和统计分析（D）HEK293细胞在H 2 O 2>和DTT添加（图4）。
注意：如果探头在测量过程中被完全氧化，并且无法响应饱和H 2

图4.表达线粒体H 2 O 2传感器mitoHyPer的HEK293细胞的示例性ROS测量。在成像之前48小时，使用基于Fugene HD的溶液，用mitoHyPer传感器转染HEK293细胞。首先用50μM和500μMH 2 O 2滴定细胞用于探针的氧化。在H 2 O 2 O 2清除之后，用2mM DTT滴定细胞以还原探针。荧光强度比的变化表示为合并图像（420nm绿色，505nm红色）。如（A）所示，加入H 2 O 2 2引起探针氧化并增加信号比率，而添加DTT降低信号比率。（B）中放大显示（A）中的指示区域。由于线粒体H 2 O 2在细胞静息状态下产生，所以探针可以被组成性产生的ROS部分氧化，并且可以通过膜渗透还原剂还原作为DTT。（D）中的（C）和（D）中的统计分析（平均值±SEM，n = 17）中示出对应于（A）和（B）中的图像的时间进程。比例尺= 10微米。

食谱

林格缓冲液（0.25mM Ca 2 +，pH7.4）
155 mM NaCl
4.5 mM KCl
10 mM葡萄糖
5毫米HEPES
2.75mM MgCl 2•/ 2 0.25 mM CaCl 2 2/2

致谢

德国研究基金会（DFG）通过SFB1190项目17，SFB1027项目C4和BO3643 / 3-2研究资助（均为IB）支持这项工作。作者声明没有利益冲突或竞争的财务利益。

参考

Belousov，V.V.，Fradkov，A.F.，Lukyanov，K.A.，Staroverov，D.B。，Shakhbazov，K.S.，Terskikh，A.V。和Lukyanov，S。（2006）。细胞内过氧化氢的遗传编码荧光指示剂 Nat Methods 3（4）：281-286。
Bilan，D.S。和Belousov，V.V。（2017）。氧化还原生物学的新工具：从成像到操作。 Free Radic Biol Med 109：167-188。
Bogeski，I.和Niemeyer，B. A.（2014）。氧化还原调节离子通道。抗氧化还原信号 21 （6）：859-862。
Chandel，N.S。（2015）。线粒体作为信号转导细胞器的进化细胞代谢 22 （2）：204-206。
Cierlitza，M.，Chauvistre，H.，Bogeski，I.，Zhang，X.，Hauschild，A.，Herlyn，M.，Schadendorf，D.，Vogt，T.和Roesch，A.（2015）。线粒体氧化应激作为克服黑色素瘤细胞亚群内在耐药性的新型治疗靶点 Exp Dermatol 24（2）：155-157。
Gibhardt，C. S.，Zimmermann，K. M.，Zhang，X.，Belousov，V.V.和Bogeski，I。（2016）。使用遗传编码荧光指示剂成像钙和氧化还原信号细胞钙 60（2）：55-64。
Ermakova，Y. G.，Bilan，D. S.，Matlashov，M. E.，Mishina，N.M.，Markvicheva，K.N.，Subach，O.M。，Subach，F.V.，Bogeski，I.，Hoth，M.，Enikolopov，G.and Belousov，V.V。（2014）。红色荧光基因编码的细胞内过氧化氢指示剂 Nat Commun公司5：5222。
Gutscher，M.，Pauleau，A.L.，Marty，L.，Brach，T.，Wabnitz，G.H.，Samstag，Y.，Meyer，A.J。和Dick，T.P。（2008）。细胞内谷胱甘肽氧化还原电位的实时成像。 / 5（6）：553-559。
Gutscher，M.，Sobotta，M. C.，Wabnitz，G. H.，Ballikaya，S.，Meyer，A. J.，Samstag，Y。和Dick，T. P.（2009）。 H 2 O 2基于接近度的蛋白质巯基氧化 J Biol Chem 284（46）：31532-31540。
Habich，M.和Riemer，J。（2017）。完整哺乳动物细胞线粒体蛋白中半胱氨酸氧化还原状态的检测方法Mol Biol 1567：105-138。
Hernandez-Barrera，A.，Quinto，C.，Johnson，E.A.，Wu，H.M.，Cheung，A.Y.和Cardenas，L.（2013）。使用hyper作为分子探针来观察活体植物细胞中的过氧化氢：一种几乎没有潜力的方法在植物生物学中。 Methods Enzymol 527,275-290。
Idelchik，M.，Begley，U.，Begley，T.J。和Melendez，J.A。（2017）。线粒体ROS控制癌症
Kasozi，D.，Mohring，F.，Rahlfs，S.，Meyer，A.J。和Becker，K。（2013）。疟疾寄生虫中的细胞内谷胱甘肽氧化还原电位的实时成像恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）。 PLoS Pathog 9（12）：e1003782。
Kuznetsov，A.V.，Kehrer，I.，Kozlov，A.V.，Haller，M.，Redl，H.，Hermann，M.，Grimm，M。和Troppmair，J。（2011）。细胞压力下线粒体ROS的产生：不同检测方法的比较 Bioanal Chem 400（8）：2383-2390。
Lismont，C.，Walton，P.A。和Fransen，M.（2017）。使用基于RoGFP2的探针定量监测活哺乳动物细胞中的亚细胞氧化还原动力学 <方法Mol Biol 1595：151-164。
马拉什夫，ME，Bogdanova，YA，Ermakova，GV，Mishina，NM，Ermakova，YG，Nikitin，ES，Balaban，PM，Okabe，S.，Lukyanov，S.，Enikolopov，G.，Zaraisky，AG和Belousov，VV （2015年）。荧光比率pH指示剂SypHer2：在神经科学和再生生物学中的应用 Biochim生物物理学报1850（11）：2318-2328。
Morgan，B.，Sobotta，M.C。和Dick，T.P。（2011）。测量E（GSH）和H 2 O <2> <2>

基于roGFP2的氧化还原探针。 Free Radic Biol Med 51（11）：1943-1951。
Müller，A.，Schneider，J. F.，Degrossoli，A.，Lupilova，N.，Dick，T.P.和Leichert，L. I.（2017）。系统性体外研究基于roGFP2的探针对生理相关反应的评估氧化剂物质。自由基生物医学药物 106：329-338。
Norcross，S.，Trull，K. J.，Snaider，J.，Doan，S.，Tat，K.，Huang，L。和Tantama，M.（2017）。通过forster型共振能量转移继电器扩展roGFP发射，可以在活细胞中同时进行双隔室比例式氧化还原成像。 ACS Sens 2（11）：1721-1729。
Poburko，D。，Santo-Domingo，J。和Demaurex，N。（2011）。细胞质钙升高过程中线粒体质子梯度的动态调节 J Biol Chem 286（13）：11672-11684。
Ralph，S. J.，Rodriguez-Enriquez，S.，Neuzil，J.，Saavedra，E。和Moreno-Sanchez，R.（2010）。重新审视癌症的原因：“线粒体恶性肿瘤”和ROS诱导的致癌转化 - 为什么线粒体是靶点用于癌症治疗。 Mol方面Med 31（2）：145-170。
Reczek，C.R。和Chandel，N.S。（2015）。 ROS依赖的信号转导 Curr Opin Cell Biol 33：8-13。
Shadel，G. S.和Horvath，T. L.（2015）。生物体内稳态的线粒体ROS信号传递 163（ 3）：560-569。
Willems，P.H.，Rossignol，R.，Dieteren，C.E.，Murphy，M.P。和Koopman，W.J。（2015）。氧化还原平衡和线粒体动力学。细胞代谢 22（2）：207-218。