材料和试剂

过滤器尖端，透明，无菌F. Gilson P1000,60盒/箱（Greiner Bio One International，目录号：740288）
Gilson P-200,96 PCS /盒（Greiner Bio One International，目录号：739288）。
标准过滤器尖端，20微升，透明，通用，无菌，每个机架96件（Greiner Bio One International，目录号：774288）。
土壤研磨SK38 2毫升管（Bertin Technologies，目录号：KT03961-1-006.2）。
的Eppendorf ®管3810X，将1.5ml，G-安全®离心稳定性，Eppendorf优质 TM ，无色，1000个。（Eppendorf，目录号：0030125150）
无水乙醇，EMSURE ACS，ISO，Reag。 Ph.Eur。分析试剂（Merck，Millipore Sigma，目录号：1.00983.1000）
UltraPure TM DNase / RNase-Free蒸馏水（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10977035）。
QIAamp Fast DNA Stool Mini试剂盒（QIAGEN，目录号：51604），包含以下内容：
1. QIAamp迷你旋转柱
2. 收集管（2毫升）
3. InhibitEX Buffer
4. 蛋白酶K
5. 缓冲区AL
6. 缓冲AW1集中
7. 缓冲AW2浓缩液
8. 缓冲区ATE

设备

Finnpipette F1,100至1,000μl（Thermo Fisher Scientific，目录号：4641100N）。
Finnpipette F1,20至200μl（Thermo Fisher Scientific，目录号：4641080N）
Finnpipette F1,2至20μl（Thermo Fisher Scientific，目录号：4641060N）。
烧杯
-80°C冷冻机
Precellys 24（Bertin Technologies，目录号：EQ03119.200.RD00.0）
带有加热块的Thermoshaker用于24 x1.5 ml微管（Grant Instruments，目录号：PHMT-PSC24N）
具有用于1.5 / 2ml管的转子的微量离心机5417R（Eppendorf，型号：5417R，目录号：2262 180-7）。
涡旋混合器（Merck Eurolab，目录号：MELB 1719）
NanoDrop分光光度计

程序

粪便样品收集

从小鼠中收集1-2个新鲜的粪便颗粒到土壤研磨的SK38 2ml试管中。一只手握住老鼠收集新鲜的粪便颗粒，在此过程中，可以直接将粪便排入另一只手握住的SK38 2ml试管中。或者，可将个别小鼠放入无菌烧杯中几分钟，然后从烧杯中收集新鲜的粪粒。重要的是要在一天中在Sametime周期实验队列内收集从所有动物粪便样品是重要的，因为它其中报告DASS模具以及微生物群组成显示昼夜振荡（Thaiss 等人，2014）。
将含有粪便颗粒的土壤研磨SK38 2ml试管储存在-80℃直至进一步处理。粪便DNA提取，因此可以从新鲜的粪便颗粒立即开始，但内实验队列所有样品应该是所有新鲜或全部冻结，以避免存储的工件，如冷冻其中显示影响厚壁菌门的<比率/粪便样品 to Bacteroidetes （Bahl et。，2012）。

粪便DNA提取
粪便DNA提取用QIAamp 执行的®快速DNA粪便Mini试剂盒gemäß制造商的与由珠磨额外的机械裂解指令详述如下：

加入1ml InhibitEX缓冲液到含有粪便颗粒的土壤研磨SK382ml管中。取自-80°C冰柜的粪便颗粒可以立即使用，因为不需要。
均质粪便颗粒在1ml Inhibitex ®缓冲器通过使用Precellys珠磨® 24在6500转2×30秒。
将步骤B2的粪便匀浆转移到无菌的1.5ml微量离心管中，注意避免转移锆珠。
在70℃加热5分钟的热匀浆中的粪便匀浆，同时在1100rpm振荡，以促进细菌的进一步裂解。
将来自步骤B4的粪便匀浆在室温下在20,800×gg下离心1分钟以沉淀粪便颗粒。
在平均时间，移液管15微升蛋白酶K从QIAamp试剂®快速DNA粪便Mini试剂盒到新鲜无菌1.5ml微量管中。
吸取步骤B5的200μL粪便匀浆上清液到含有1.5ml微量离心管的蛋白酶K中。
添加200μl缓冲液AL到1.5ml微量管中含有200微升上清液，蛋白酶K（来自步骤B7），并涡旋15秒，以形成均匀的悬浮液。
在70℃加热10分钟，同时摇动1,100转
在悬浮液中加入200μl无水乙醇并涡旋混合
QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit中提供的QIAamp离心柱。
关闭QIAamp离心柱，并在室温下以20,800×g g离心1分钟。
将QIAamp离心柱置于新的2 ml收集管中，丢弃含有滤液的旧收集管。
向QIAamp离心柱中加入500μl缓冲液AW1。
注意：缓冲区AW1是作为浓缩物提供的。当使用新鲜的瓶子时，首先将25毫升无水乙醇加入到AW1浓缩物中，并通过重悬来彻底混合。
关闭QIAamp离心柱，并在20,800×gg室温下离心1分钟。
将QIAamp离心柱置于新的2 ml收集管中，丢弃含有滤液的旧收集管。
向QIAamp离心柱中加入500μl缓冲液AW2。
注意：Buffer AW2是作为浓缩物提供的。当使用新鲜的瓶子时，首先将30毫升无水乙醇加入到AW2浓缩物中，并通过重悬来彻底混合。
关闭QIAamp离心柱，并在室温下以20,800×g g离心3分钟。
将QIAamp离心柱置于新的2 ml收集管中，丢弃含有滤液的旧收集管。
为了减少缓冲AW2残留的机会，在室温下以20,800xg克再次离心3分钟。
将QIAamp离心柱置于新鲜的1.5ml微量离心管中，丢弃含有滤液的旧收集管。
向QIAamp离心柱中加入200μlUltraPure™DNase / RNase-Free蒸馏水以洗脱DNA。
注：“DNA可以因此使用200微升的缓冲液洗脱ATE通过QIAamp试剂 ® 快速DNA粪便Mini试剂盒提供。 /
在室温下孵育1分钟
在20,800×g的室温下离心1分钟以收集DNA。
丢弃QIAamp旋转栏。
关闭含有洗出液的1.5ml微量离心管，并将DNA储存在-20℃直至进一步使用。这个协议获得的粪便DNA的数量因样本而异，并且取决于用于提取DNA的粪便的量。在我们的手中，获得的粪便DNA的量在每毫升粪便50-500ng DNA之间变化，平均每mg粪便约150ng DNA。由于一个粪便颗粒重量至少为20毫克，所以使用这个方案可以获得至少1微克的粪便DNA。因此，当粪便DNA在200μl的超纯水 TM DNA酶/ RNA酶的蒸馏水（见步骤A22），粪便DNA的从任何给定的样品所获得的浓度将是至少5纳克的溶解/μl。

数据分析

将所得到的粪便DNA的浓度和质量可以通过纳米滴分析来测定，其中，在260nm / 230 nm和260nm处/ 280nm的吸光度比可以是确定性的开采评价提取的DNA的纯度，这应该是围绕两个和1.8，分别。下游系统发育16S rDNA微生物群分析始于对25ng粪便DNA的PCR。因此，由于该方案以5ng /μl的浓度产生至少1μg的DNA，所获得的DNA量不是限制因素。进一步的系统发育16S rDNA微生物群分析程序在我们以前的研究中概述（Mamantopoulos等，2017）。

确认

A. W.通过从科学研究基金龙龙的奥德修斯授予G.0C49.13N支持，是一个博士后与科研龙龙基金。作者没有任何利益冲突。

参考

Bahl，M.I.，Bergstrom，A。和Licht，T.R。（2012）。之前DNA提取冻结的粪便样品的影响的厚壁菌至。拟杆菌比确定性由下游定量PCR分析代码开采 FEMS微生物学快报 329（2）：193-197
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