材料和试剂

移液枪头和微量移液器（Gilson，目录号：K31-1001B，K31-201Y，K31-11）。
培养皿（Sigma-Aldrich，目录号：P5731）
制造商：Excel Scientific，产品目录号：D-910。
微型手术刀
T75培养瓶
15毫升管（康宁，目录号：430791）
24孔组织板（Eppendorf，目录号：0030722019）
小鼠
等级：出生后第7天（P7）从Brain Institute（UFRN，Natal）的动物设施使用C57BL / 6小鼠。所有的动物手术均按照国家和国际法律进行，并经当地的道德委员会（CEUA / UFRN，许可号＃008/2014）批准。
Hank平衡盐溶液（HBSS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：14025092）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM9625）。
Tryple解离试剂（Thermo Fisher Scientific，Gibco，产品目录号：12604013）。
聚-D-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P0899）。
Nucleofection设备和套件
1. 4D nucleofector（LONZA）X单位
2. 16孔核酸酶条（20μl）
3. 原始细胞P3（Lonza，目录号：V4XP-3032）的溶液。
星盘（见食谱）
DMEM-F12（Thermo Fisher Scientific，Gibco，产品目录号：12634010）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10082147）。
马血清（HS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：16050122）
青霉素/链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
葡萄糖（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：A2494001）
B27（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：17504044）
表皮生长因子（EGF）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：P35375）
成纤维细胞生长因子2（FGF2）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：68-8785-82）。
分化培养基（见食谱）
DMEM / F12（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：12634010）。
葡萄糖（Sigma-Alrich，目录号：G8270）
青霉素/链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15070063）
B27（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：17504044）
脑源性神经营养因子（BDNF）（Sigma-Aldrich，目录号：B3795）。

设备

解剖显微镜（蔡司，型号：Stemi DV4）
孵化器（Shell Lab CO 2孵化器）
冷冻离心机（海蒂诗实验室技术，型号：Rotina 420 R）
Nucleofection装置（Lonza，4D nucleofector控制器和X单元）（Lonza，型号：4D Nucleofector TM）
1.000μl微量移液器

软件

GraphPad Prism版本5.00

程序

注意：以下协议应在无菌环境中进行。预计对基本的细胞培养有一定的了解。

第一天：解剖和组织电镀
注意：在解剖之前，预热星盘并准备冰冷的HBSS。
1. 删除P7幼崽大脑的大脑
2. 将大脑转移到装满冰冷HBSS的培养皿中。
3. 保持大脑在腹侧向下的位置，并使用刀片做出两个冠状切口（图1，第1步）。做第一次切割附近的视交叉和第二个2-4毫米进一步caudally获得2-4毫米厚冠状切片。
  
  图1.出生后的星形胶质细胞培养。上图显示了皮层和小脑星形胶质细胞培养的主要步骤。红色虚线表示切割的大致区域。左下图（A-D）显示80％铺满的两种培养物和星形胶质细胞标记物GFAP（红色）和神经元标记物BIII微管蛋白（绿色）的免疫染色。量化显示＆gt;两种培养物中97％的细胞是GFAP + / BIII-微管蛋白 - （E）。 Cereb =小脑，Ctx =皮层，Astro =星形胶质细胞。核用DAPI（蓝色）染色，比例尺=25μm。
4. 将小脑与大脑其余部分分开（图1，步骤2）。
5. 在解剖显微镜下去除冠状切片和小脑的脑膜。确保摆脱小脑盘旋之间的脑膜，因为脑膜可能是污染成纤维细胞和/或巨噬细胞的来源。
6. 使用立体显微镜放大从前脑获得的冠状切片，并用微型手术刀将灰质与白质分开（图1，步骤2）。
7. Eppendorf管充满1毫升冰冷HBSS（图1，第3步）。
8. 使用1.000微升的微量移液器，上下移动组织6到8次，以获得1-2毫米的小块。
9. 等待2分钟，让组织在管底部倾倒。
10. 丢弃HBSS，并悬挂在500μL预热星形脐橙组织块（见食谱）。
11. 将来自两个区域的组织片放入含有10ml预热的星状体的单独的T75培养瓶中（图1，步骤4）。
12. 在37℃，5％CO 2下温育培养物（图1，步骤5）。
评级：因为星形胶质细胞很好地附着在塑料上，所以不需要以前的烧瓶涂层处理。使用T75烧瓶皮质灰质的2个大脑和小脑的T75烧瓶1脑，因为从小脑的星形胶质细胞比从皮质的星形胶质细胞增殖快两倍。请注意，组织碎片仍处于悬浮状态。因此，建议在未来3天内不要移动盘子。这将允许星形胶质细胞附着在烧瓶的底部。
第3天。淘汰少突胶质细胞和更换培养基。
评级：在光学显微镜下检查细胞培养。在第3天，您应该能够看到所有的烧瓶细胞（首先出现的细胞通常由30-50个细胞组成）。如果没有足够的细胞再等待一天。当细胞准备好，预热的PBS和新鲜制备的星形胶质细胞
1. 从培养瓶中吸出培养基并丢弃（图1，第6步）。
2. 用10 ml预热的PBS彻底摇动培养瓶，摇晃培养瓶（图1，第7步）。
3. 丢弃洗涤PBS，并添加10毫升的预热新鲜星形。
4. 在37℃，5％CO 2下温育细胞（图1，步骤8）。
注：星形胶质细胞强烈地附着在烧瓶的塑料上，不想分开。因此，不要犹豫，彻底清洗，因为这将有助于摆脱污染小胶质细胞，少突胶质细胞和最终的神经元。
第10天星形胶质细胞nucleofection
评分：更换培养基后七天，星形胶质细胞培养必须达到80-90％汇合。此时细胞已准备好用于进一步的实验。注意从小脑分离的星形胶质细胞可能比从皮质分离的星形胶质细胞提前一到两天达到这个汇合速率。
1. 吸出所有的星盘并丢弃。
2. 向每个培养瓶中加入5ml Tryple解离试剂（Gibco），并在室温下孵育10-15分钟。
3. 吸取细胞进一步解离（10次）。
4. 收集所有的细胞在15毫升管。
5. 在300℃下离心10分钟，4℃
6. 丢弃上清。
7. 将细胞悬浮在1毫升DMEM-F12中并计数。
注意：使用Tryple解离后不需要停止溶液。在这个协议tryple是胰蛋白酶更好的选择。细胞分离更快，生存率更高。
1. 在核转染之前，将原代细胞溶液P3在室温下孵育20分钟。
2. 轻轻吹打3次，将10μl细胞悬浮于20μlP3溶液中。
3. 轻轻地添加1-2微克质粒DNA到细胞悬液
4. 在核转染孔中滴入细胞/ DNA悬浮液（20μl/孔）。
5. 进入nucleofector 4D X-unit内部的比色杯，选择哺乳动物神经胶质细胞程序EM110。
6. 核转染后，取出条，让它在室温下静置5分钟，然后再回收细胞。
7. 从井中吸出细胞，并暂停在预热的星形胶质。
8. 在含有星形胶质（500μl/孔）的聚-D-赖氨酸包被的24-孔组织平板中以70,000至100,000个细胞/孔的密度铺板细胞（见图2）。
  
  图2.星形胶质细胞nucleofection。上方案例说明使用4D nucleofector（LONZA）的星形胶质细胞nucleofection的主要步骤。下图显示用pCAG-Ascl1-IRES-DsRed核转染后24小时的小脑星形胶质细胞（GFAP +）的例子（A）。星形胶质细胞表达报告荧光（RFP +）（白色箭头）（B，C）。比例尺= 25微米。
注：重要的是要防止气泡形成在加载细胞/ DNA悬浮液至孔中。这将防止更多的细胞死亡。所以我们观察到细胞簇比完全分离的细胞对核转染更具抗性。最好在已经加热和平衡的培养基中培养细胞。细胞核转染效率和细胞死亡从一个实验到另一个实验变化很大。在这个协议中星形胶质细胞用pCAG-Neurog2-IRES-DsRed的，pCAG-ASCL1-IRES-DsRed的或对照质粒pCAG-IRES-DsRed的核转。然而，可以按照相同的方案使用其他质粒。最佳的DNA浓度可能会有所不同。因此，不同的DNA浓度应在中试实验中进行测试。这同样适用于核子转移计划。细胞数，DNA浓度和选定的程序：一个最佳折衷shoulderstand通过测试以下变量的所有被发现。使用该协议，我们可以立即观察荧光报道分子表达作为转染效率核转染后4小时，什么高于60％两种星形细胞群。

数据分析

神经元重编程和INS表型的定量体外必须在细胞培养物中的至少三个独立的批次进行。但是，每个实验必须确定确切的抽样大小。对于Windows或其他统计程序，可以使用GraphPad Prism版本5.00进行统计测试。统计检验的选择必须根据实验设计。对于可能的分析使用描述的星形胶质细胞培养物的例子，请参阅Chouchane及其同事（2017）（ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/labs/articles/28602612/代码）。

食谱

天文星
含有的DMEM-F12：
10％胎牛血清（FBS）
5％马血清（HS）
1％青霉素/链霉素
3.5mM葡萄糖
以10ng有2％B27，表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（FGF2），每个补充/ ml的
等级：星形体可以在4℃下保存1周。但是，在使用前应该添加新的生长因子。
分化培养基
含有的DMEM / F12：
3.5mM葡萄糖
1％青霉素/链霉素
2％B27
注意：此介质可以在20纳克/毫升的分化过程的每五天，以提高诱导
神经元的存活被补充脑源性神经营养因子（BDNF，Sigma-Aldrich公司）。

确认

国家科学和技术发展委员会（CNPq）支持这项工作。目前的协议从海因斯的等什么调整。的，2002年和Berninger的等的，2007年的作者宣称没有利益或竞争利益冲突。

参考

Berninger，B.科斯塔，M. R.，科赫，U.，施罗德，T.，森特，B. GROTHE，B。和郭茨，M。（2007）。从体外重编程的星形胶质细胞产后来源的神经元的功能特性。 Ĵ神经科学 27（32）：。8654-8664
Chouchane，M.，梅洛•法里亚斯，A. R.，莫拉，D. M. S.，希尔舍，M. M.施罗德，T.，莱奥，R.N。和科斯塔，M. R.（2017）。从不同来源星形胶质细胞的谱系重编程为不同的神经元亚型。干细胞报告 9（1）：162-176。
Heinrich，C.，Gotz，M.和Berninger，B。（2012）。鼠标新皮层为功能，突触形成神经元星形胶质细胞产后的重新编程。 <方法Mol Biol 814：485-498。
海因斯，N.，马拉泰斯塔，P.，CECCONI，F.，Nakafuku，M.，塔克，K. L.，哈克，M.A.，Chapouton，P.，Barde，Y A。和郭茨，M。（2002）。神经胶质细胞产生神经元：转录因子Pax6的代码纳特的作用。 Neurosci 5（4）：308-315。
Saura，J。（2007）。小神经胶质细胞在星形胶质培养物：一个警示注意此代码的Ĵ神经炎症
Schildge，S.，Bohrer，C.，Beck，K.和Schachtrup，C。（2013）。分离和培养小鼠皮层星形胶质细胞。 Ĵ显示精通（71）。