材料和试剂

棉签（Fisher Scientific，目录号：23-400-122）
制造商：Thermo Fisher Scientific，产品目录号：16F0024。
碳钢手术刀＃20（Aspen Surgical，Bard-Parker，目录号：371120）
培养皿（VWR，目录号：25384-302）
6孔组织培养板（Corning，Falcon，目录号：353046）
无菌微量离心管（1.7ml）（Sorenson BioScience，目录号：16070）
无菌15毫升锥形管（VWR，目录号：21008-216）
无菌聚酯涂抹器（Fisher Scientific，目录号：23-400-122）
移液管吸头（1,000μl：VWR，目录号：83007-382;200μl：VWR，目录号：53509-007;0.1-10μl：Fisher Scientific，目录号：02-717-133）
用于免疫染色的PAP笔（Sigma-Aldrich，目录号：Z377821-1EA）
制造商：TED PELLA，产品目录号：22309。
VWR Micro Slides Superfrost Plus（VWR，目录号：48311-703）
蔡司NO.1.5盖玻片（蔡司，目录号：474030-9000-000）
Polysciences平包埋模具1.2 x 0.5 x 0.4厘米（长x宽x深）（Polysciences，目录号：02615）
MS11淋病奈瑟氏球菌菌株（由沃尔特•里德陆军研究所的Herman Schneider博士提供）
Hank's平衡盐溶液（HBSS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：14025092）
液氮（罗伯茨氧气公司）
Hoechst 33342，三盐酸盐，三水合物，10mg / ml（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：H3570）
Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG 1（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A-21121）
小鼠抗人ZO1（BD，Transduction Laboratories TM，目录号：610966）
山羊抗GC抗体（实验室产生）
DyLight 633抗体标记试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：53046）
Aqua Poly / Mount（Polysciences，产品目录号：18606）
指甲油（电子显微镜科学，目录号：72180）
O.C.T.化合物（SAKURA，Tissue-Tek，目录号：4583）
青霉素G钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：P3032-25MU）
硫酸链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：S9137）
Leibovitz's（1×）L-15培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：21083027）
CMRL培养基1066（1x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11530037）
氢化可的松21-半琥珀酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：H2270-100MG）
牛胰岛素（Akron Biotech，目录号：AK8213-0100）
L-谷氨酰胺200mM（100x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25030081）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10082147）
DifcoTM GC培养基（BD，Difco TM，产品目录号：228950）
琼脂（美国生物，目录号：A0930）
L-谷氨酰胺，白色晶体或结晶粉末（Fisher Scientific，目录号：BP379-100）
硝酸铁，九水合物（Sigma-Aldrich，目录号：254223-10G）
硫胺素焦磷酸（Sigma-Aldrich，目录号：C8754-5G）
葡萄糖，如无水葡萄糖（Fisher Scientific，目录号：BP350-1）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S671-10）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333-500G）
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（Fisher Scientific，目录号：S374-1）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Fisher Scientific，目录号：BP329-1）
盐酸（HCl）（Fisher Scientific，目录号：A144-212）
制造商：Thermo Fisher Scientific，产品目录号：FLA144212。
多聚甲醛16％溶液（电子显微镜科学，目录号：15710）
蔗糖（Merck，目录号：SX1075-1）
来自猪皮的明胶（Sigma-Aldrich，目录号：G1890-500G）
来自冷水鱼皮（FSG）的明胶（Sigma-Aldrich，目录号：G7765-250ML）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100-100ML）
100倍青霉素/链霉素库存（见食谱）
宫颈组织培养基（见食谱）
GCK琼脂平板（见食谱）
100倍凯洛格的补充（见食谱）
1x磷酸缓冲液（PBS）（见食谱）
4％多聚甲醛（PFA）（见食谱）
5％和15％蔗糖溶液（见食谱）
7.5％和20％的明胶溶液（见食谱）
染色液（见食谱）

设备

生物安全柜（NU-425-600 Class II，A2层流生物危害罩）（Nuaire，型号：NU-425-600 Class II，A2，目录号：32776）
分光光度计Ultrospec 2000 UV（Pharmacia Biotech，型号：80-2106-00）
加热块（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：SP18425Q）
不锈钢钳（VWR，解剖钳）
多功能旋转器（多功能旋转器）（Barnstead International Lab-line，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Model 2309）
CO 2培养箱（Fisher Scientific，型号：Isotemp培养箱，型号3530）。
共焦显微镜（卡尔蔡司，型号：LSM 710）
Cryostat（Thermo Fisher Scientific，型号：Microm HM 550-388114）
幻灯片架（新人供应，目录号：6841）

软件

NIH ImageJ和ZEN软件
GraphPad软件（La Jolla，CA）

程序

样品收集和运输
使用1x青霉素/链霉素的无菌DMEM（参见食谱）在手术后24小时内在4℃下获得子宫颈切除术（5g /块），2011），由国家疾病研究交流中心（NDRI）协调（机构审查委员会必须批准涉及人体组织的研究协议，请与您自己的机构审查委员会核实有关规定）。
组织准备
基于Schürch等人描述的方法培养组织外植体。（1978）。
1. 用冷HBSS冲洗纸巾三次。
2. 用冷的Leibovitz（1x）L-15培养基冲洗纸巾3次。
3. 使用棉签轻轻地去除粘液
4. 使用碳钢手术刀去除肌肉组织（图1A，黑色虚线）
5. 使用碳钢外科刀片将子宫颈内区域与子宫颈组织外植体的其余部分分开（图1A）。存储endocervix协议的下一个步骤，而宫颈的其余部分被丢弃。
6. 用宫颈组织培养基冲洗宫颈组织外植体三次
7. 在宫颈组织培养基中，在37℃，5％CO2下孵育宫颈内组织培养板6孔组织培养板，每孔一个，24小时。
8. 拍摄组织的照片
9. 通过使用NIH ImageJ软件测量组织对大小的比例来确定组织腔表面的面积（图1B中的虚线）。
10. 用无抗生素的宫颈组织培养基清洗宫颈组织外植体三次（见食谱），并将组织在无抗生素的培养基中于37℃用5％CO 2孵育24小时细菌接种。
  
  图1宫颈组织外植体的培养将子宫颈组织（A）取出宫颈粘液，肌肉组织及其他部位后，剪成所需的大小（B），在颈椎将组织培养基置于六孔板中。黑色的虚线表示组织上的切割线，黄色的虚线表示宫颈管腔的表面。比例尺= 10毫米。
气雾剂感染endocervix
1. 在GCK琼脂平板上生长GC（见食谱）16-18小时。
2. 用无菌涂药器收集GC，从平板上擦拭GC，在预热的无抗生素宫颈组织培养基中重新悬浮GC。通过分光光度法在650nm波长（1×10 9 CFU / ml的OD 650）下测定细菌的数量。
3. 通过将组织外植体的腔表面积除以各个宫颈上皮细胞（25μm2）的平均腔表面积（图3D）来估计上皮细胞的数量。
4. 直接在每个组织片上加入等分试样的GC悬浮液（1ml）以制备MOI = 10个细菌至1个上皮细胞，并在37℃下用5％CO 2孵育3分钟。 br />
5. 每个上述组织片添加1毫升无抗生素宫颈组织培养基（见食谱）。
6. 在37℃下用5％CO 2孵育组织外植体，轻轻摇动24小时。用3ml无抗生素宫颈组织培养基在6和12小时清洗感染组织外植体6次，以去除未粘附的细菌，并用2ml新鲜培养基替换，而不含细菌。
冷冻固定的组织准备
1. 用3毫升的PBS冲洗组织外植体三次（见食谱）。
2. 用3ml 4％多聚甲醛（在PBS中）固定组织外植体（参见食谱），室温下1小时。
3. 用PBS冲洗组织外植体三次
4. 使用剃刀将组织切成所需尺寸，大约1.0×0.5×0.2cm（长×宽×深）。
冷冻切片的组织准备 - 渗透＆amp;嵌入
1. 将组织外植体在室温下在5ml含5％蔗糖的PBS（参见食谱）中室温孵育30分钟，直到外植体沉降到管底。
2. 小心地取出5％的蔗糖，并悬浮在5毫升15％蔗糖（在PBS中）的组织（见食谱），并在4°C孵育过夜。
3. 小心取出蔗糖，并在PBS中7.5％猪皮明胶重新悬浮组织外植体（见食谱）在37°C 4小时。
4. 小心地取出明胶溶液，并重新悬浮组织外植体5毫升预热20％猪皮明胶在PBS中（见食谱），并在37°C温育2小时。
5. 在一个加热块上预热一个扁平包埋模具（图2A）
6. 用20％的明胶填充模具的底部1/3，并在室温下固化。
7. 每个模具放上一块薄纸，顶部放上20％的明胶，37℃。如图2A所示使用移液管尖端来排列组织的取向，以在顶部具有腔表面。确保组织块完全嵌入明胶（图2B）。
8. 让样品在室温下放置5分钟，然后在冰块上放置10分钟。
9. 使用长镊子将含有组织的霉菌放入液氮蒸气中直至明胶变白。
10. 将模具浸入液氮中几秒钟，直到样品全部冷冻。
11. 通过在42°C的加热块上加热模具底部30秒，将样品块从模具中推出。
12. 将嵌入的样品储存在-80°C的锥形管中。
冰冻切片
1. 在低温恒温器的台面上放置一个样品块，使其能够穿过管腔表面和上皮下层（图2C）。
2. 切片样本块40微米厚，直到到达组织。
3. 切换到所需的部分厚度从10-40微米
4. 收集样品部分，将其连接到载玻片上（图2C）。
5. 将玻片上的冷冻切片放置在4°C的同一天处理或-20或-80°C以备将来处理。
  
  图2.宫颈内膜组织的嵌入和切片图A-B。将宫颈内侧组织以20％明胶包埋。黑色箭头，组织定位的方向。 C.宫颈组织块横向穿过腔表面和上皮下组织。宫颈组织切片收集使用超级霜加幻灯片进行免疫荧光染色。
免疫荧光染色成像
1. 用42℃的PBS在载玻片上的玻片上孵育组织切片10分钟，以去除明胶。
2. 用PBS清洗组织切片三次
3. 吸取多余的PBS，并用纸笔在组织切片上画出水性屏障圈。
4. 用染色溶液填充圆圈（参见食谱）并在室温下孵育1小时进行透化和封闭。
5. 在染色溶液中室温孵育组织切片与第一抗体1小时。（表1）
  
  表1.图2和3中使用的抗体/化学物质和最终浓度
  
  注：荧光鬼笔环肽和免疫荧光E-钙粘蛋白染色也可以包括在内以评估GC的细胞定位。
6. 用染色液冲洗组织切片三次
7. 在染色溶液中用二次抗体在室温孵育组织切片1小时。（表1）
8. 用染色液冲洗组织切片三次。
9. 用Hoechst33342（0.2μg/ ml）在染色溶液中室温孵育组织切片10分钟。（表1）
10. 用染色液冲洗组织切片三次
11. 使用Aqua /聚安装媒体和1.5号或1号盖玻片安装组织切片。干燥5分钟，然后用指甲油密封盖玻片的边缘。
12. 幻灯片现在可以进行成像，或者可以在4°C下保存2个月。
成像
1. 使用蔡司LSM 710共聚焦显微镜（可使用等效显微镜）获取图像。
2. 从组织切片的顶部到底部采集0.37μm切片的Z-叠层（图3A）
3. 使用ImageJ或ZEN软件（图3B）将Z-Stack图像重建为三维图像，从而获得宫颈上皮细胞的横向（图3C）和管腔视图（图3D）。
  
  图3：荧光图像的三维重建对宫颈组织外植体的低温切片进行染色，， GC（红色）和 DNA（蓝色）。使用共焦荧光显微镜拍摄Z-堆叠图像。所示为一系列的Z-堆叠图像（A）及其三维重建（B）。然后生成管腔表面的XZ视图（C）和XY视图（D）的图像用于出版。红色虚线环绕上皮细胞的腔表面（〜25μm2）。比例尺= 10微米。

数据分析

在我们发表的研究中，我们定量分析了气管上皮细胞在宫颈上皮内的渗透和宫颈上皮细胞的脱落。

为了估计GC渗透到上皮下的水平，目视统计在基底侧具有GC染色的非脱落的宫颈上皮细胞（在可见的上皮单层中）和随机获取的图像中的GC相关上皮细胞的总数目计算GC渗透到上皮细胞中的感染上皮细胞的百分比（图4A）。
为了量化上皮剥脱，在每个随机获取的图像中通过目视检查计数位于单层顶部（剥落的）上的宫颈上皮细胞的数量和宫颈上皮细胞的总数，以确定剥落细胞的百分比（图4B）。
将量化值绘制成柱状图，使用Prism（GraphPad Software，La Jolla，CA）的Student's t检验和单向ANOVA评估统计显着性。

图4.在宫颈组织外植体中GC感染的荧光图像分析。对宫颈组织外植体的低温切片进行染色，以显示出对照的结果。 ZO-1（green） DNA（blue） =“color：＃E53333;”> GC（红色）和

食谱

100x青霉素/链霉素（P / S）股票
10,000 UI / ml青霉素
10,000μg/ ml链霉素
酚红无DMEM / F12培养基
在-20°C储存
宫颈组织培养基
CMRL-1066中等
0.1μg/ ml氢化可的松21-半琥珀酸钠
1μg/ ml牛胰岛素
2mM L-谷氨酰胺
5％FBS
1x青霉素 - 链霉素（P / S）
在4°C储存
GCK琼脂平板（1升）
35克Difco GC中等基地
6克琼脂
10毫升100克凯洛格的补充
在4°C储存
100倍凯洛格的补充（1升）
5克L-谷氨酰胺结晶粉
0.5克硝酸铁，无水
0.02克焦磷酸硫胺素
400克葡萄糖
在4°C储存
1x磷酸缓冲液（PBS）（1L）
8克NaCl
0.2克KCl
1.44克Na 2 HPO 4 4 0.24克KH 2 PO 4 4 用HCl调节pH至7.4
在4°C储存
4％多聚甲醛（PFA）
30毫升16％多聚甲醛储备
10毫升1x PBS
在-20°C储存
5％和15％的蔗糖溶液
5克（5％）或15克（15％）蔗糖
100毫升1x PBS
在-20°C储存
7.5％和20％明胶溶液
7.5克（7.5％）或20克（20％）猪皮明胶
100毫升1x PBS
加热溶解
在-20°C储存
染色解决方案
1x PBS
0.66％鱼皮明胶（FSG）
0.2％Triton X-100
在4°C储存

致谢

我们要感谢NDRI的纸巾收集。这项工作得到了NIH资助（RO1 AI068888，R21 AI103797和RO1 AI123340到WS和DCS）的支持。该协议部分改编自以前由Merbah等人（2011年）和Schürch等人（1978年）发表的工作。作者声明在这项工作中没有利益冲突。

参考

Merbah，M.，Introini，A.，Fitzgerald，W.，Grivel，J.C。，Lisco，A.，Vanpouille，C.和Margolis，L。（2011）。宫颈阴道组织离体作为研究早期事件的模型HIV-1感染。 65（3）：268-278。
Schürch，W.，McDowell，E.M。和Trump，B.F。（1978）。人类子宫内膜异位症的长期器官培养。
38（11 Pt 1）：3723-3733。