材料和试剂

显微镜幻灯片（VWR，目录号：48382-171）
显微镜幻灯片的盖玻片（Fisher Scientific，Fisherbrand，目录号：12-541A）
60毫米板（Fisher Scientific，Fisherbrand，目录号：FB0875713A）
100毫米板（Fisher Scientific，Fisherbrand，目录号：FB0875713）
标签胶带（Fisher Scientific，Fisherbrand，目录号：15-901-5K）
玻璃移液器
铝箔
高压灭菌器胶带
接种循环
移液器提示
℃。线虫实验菌株：
RT258： unc-119（ed3）; pwIs50 [lmp-1 :: GFP，unc-119]
注：LMP-1是哺乳动物Lamp1的直系同源物，定位于秀丽隐杆线虫中的溶酶体（Kostich et al。，2000）。
℃。线虫控制菌株：N2
氯化钙二水合物（CaCl 2•2H 2 O）（Fisher Scientific，目录号：C79-500）
七水合硫酸镁（MgSO 4•7H 2 O）（Fisher Scientific，目录号：M63-500）
磷酸二氢钾（KH2PO4）（Fisher Scientific，目录号P285-500）
胆固醇（Sigma-Aldrich，目录号：C8667）
EtOH（Merck，目录号：EX0276-4）
LE琼脂糖用于制备2.2％琼脂糖（BioExpress，GeneMate，目录号：E-3120）
左旋咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：31742）
℃。线虫文化
1. 白金线采摘转移线虫
2. 制作NGM板材（Brenner，1974; He，2011）（见食谱）
  氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S271-3）
  细菌蛋白胨（BD，Bacto TM，目录号：211677）
  细菌琼脂（BD，Bacto TM，目录号：214030）
  双蒸水
  胆固醇5毫克/毫升在95％乙醇（见食谱）
  1 M CaCl 2无菌（见食谱）
  1M MgSO 4无菌（参见食谱）
  1 M KH 2 PO 4 pH6.0无菌（见食谱）
3. 制作2个YT + OP50来检测NGM板
  OP50冷冻库存
  2x YT琼脂平板
4. 2x YT琼脂平板（见食谱）
  细菌用胰蛋白胨（BD，Bacto TM，目录号：211705）
  酵母提取物（Fisher Scientific，目录号：BP1422-500）
  氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S271-3）
  细菌琼脂（BD，目录号：214030）
  双蒸水
5. 2x YT中等（见食谱）
6. 2x YT中等+ OP50（见食谱）
2.2％琼脂糖垫（见食谱）
9 mM左旋咪唑/ 1x PBS（见食谱）

设备

20°C孵化器 C。 elegans存储（VWR，由Sheldon Manufacturing制造，型号：2020型）
4升烧瓶
搅拌棒
搅拌盘
高压灭菌器
2升烧杯
1升瓶
37℃培养箱（VWR，由Sheldon Manufacturing制造，型号：5025T）
微波炉
加热块
5-100毫升瓶
显微镜（卡尔蔡司，型号：STEMI SV 6）
蔡司LSM 510元共聚焦显微镜（Zeiss，型号：LSM 510）：
1. 63倍镜头
2. 氩488纳米激光
3. 氦氖543纳米激光

软件

MetaMorph ®显微镜自动化＆amp;图像分析软件（Sunnyvale，CA）

程序

注意：在开始协议之前：确保准备好60毫米的NGM板（点缀OP50）。
第1天

在每个有斑点的60mm NGM板上，每个板上用三个成年雌雄同体（L4后一天）设置三个板。线虫实验和控制应变。
将盘子置于20°C培养箱中三天，使雌雄同体产卵。

第4天
移动50-100 L4阶段 C。每个实验菌株的线虫到新的OP50斑点的60mm NGM板（P0雌雄同体的后代）上。这样可以确保这些动物在第二天成为相当同步的年轻成年人进行成像。

第5天：准备显微镜

准备成像幻灯片首先制作琼脂糖垫。请参阅图1中的步骤1-4以获得说明。
接下来，加入7微升9毫米左旋咪唑/ 1x PBS（见食谱）到琼脂糖垫的中心（图1，S5）。
挑一个C的20-30成虫。线虫实验性菌株并将其浸入9mM左旋咪唑/ 1x PBS中（图1，S5）。
将盖玻片放在琼脂糖垫上，确保它完全覆盖线虫和9mM左旋咪唑/ 1x PBS（图1，S6）。
对所有使用的实验和对照菌株重复步骤1-5。
做显微镜成像LMP-1 :: GFP（或感兴趣的标记），并使用63x物镜重点在咽下面的肠。拍摄显示所需信号的图像，同时避免信号饱和。
图像线虫野生型RT258首先与氩488 nm激光和氦氖543 nm激光。应首先对RT258进行成像，因为它是野生型菌株，应与其他实验菌株的测量结果进行比较。
为野生型RT258菌株拍摄大约5-10只成虫线虫的肠的图像。
对每个对照和实验菌株重复步骤7和8。确保使用与RT258相同的曝光和放大率拍摄所有菌株的图像。

图1.成像载玻片的制备

数据分析

使用MetaMorph 7.5.0.0版分析共焦显微图像，但也可以使用其他软件
所有的共聚焦显微镜图像被转换为'.tif'格式，用于MetaMorph。
识别仅具有绿色荧光的隔室（由488nm激光激发）。这些区域是标记溶酶体的LMP-1 :: GFP阳性。黄色的隔室（用488nm和543nm激光发出的荧光）是肠道颗粒，这也将在中看到。线虫对照菌株N2：不应测量或包括这些肠道颗粒区以确定LMP-1 :: GFP区室的大小（图2）。我们不知道LMP-1 :: GFP信号在老年人中是否下降;如果是这样，这个协议可能无法有效区分真正的GFP信号和自发荧光。

图2.肠道图像的代表性图像。用543nm和488nm激发荧光的隔室是颗粒，而仅用488nm激发荧光的隔室是LMP-1 :: GFP-隔室。箭头表示LMP-1 :: GFP阳性隔室的例子。箭头表示肠道颗粒的例子。黄色圆圈表示成群的隔间。比例尺= 10微米。
对于每个LMP-1 :: GFP阳性区室，使用MetaMorph来测量所选区室的强度和面积。参见图3的图片指南（图3）。
1. 转到工具栏中的“测量”，然后选择“显示区域统计...”
2. 使用跟踪区域工具选择LMP-1 :: GFP阳性室。
3. 双击所选区域。
4. 要获得LMP-1 :: GFP阳性隔室强度的测量值，请使用“平均”灰度值。
5. 要获得LMP-1 :: GFP阳性室大小的测量值，请使用“面积”值。
  
  图3.使用MetaMorph测量LMP-1 :: GFP阳性区室大小和标记强度
6. 从每个图像收集每个成年线虫的所有LMP-1 :: GFP阳性区室的测量结果。不包括成团的隔室，因为难以获得准确的定量（由于每个隔室的位置不明确）。结果是每个图像大约有10-20个明确的隔间。
7. 使用Excel平均所有LMP-1 :: GFP阳性强度测量结果以获得每种菌株的平均LMP-1 :: GFP阳性强度。平均所有的LMP-1 :: GFP正面大小测量结果以获得每个菌株的平均隔室大小。图4描述了比较野生型菌株与杯-5（空）株（CUP-5是阳离子通道; CUP-5蛋白质的损失导致溶酶体功能障碍）时获得的结果（Fares和Greenwald，2001b; Hersh等人，2002）。 CUP-5的丢失导致LMP-1 :: GFP阳性强度增加，但是溶酶体大小没有显着变化。

注意：我们已经成功地在携带各种突变或RNAi治疗后的菌株中使用这个方案。

图4.获得的LMP-1 :: GFP强度和区室大小数据的代表性图像 *表示

笔记

“平均”灰度级越高，溶酶体室大小越大。
如果使用相同的标记对多个菌株进行成像，则使用相同的共焦设置拍摄所有图像，最好是在相同的显微镜检查过程中。这将允许比较菌株/基因型之间的隔室大小和强度。此外，虽然在技术上并不总是可行的，但是在可行的情况下，要比较的菌株应该在同一张载玻片上成像，以减少显微镜下的载玻片变化。
重复这个实验多次，以确定重复性和统计显着性
该方法可用于分析成人肠细胞中溶酶体以外的其他细胞器的标记物，区分来自消化道颗粒自发荧光的标记信号。

食谱

线虫生长培养基（NGM）琼脂（3L）
1. 将以下内容添加到4-L烧瓶中：
  NaCl（9.0克）
  细菌蛋白胨（7.5克）
  细菌琼脂（51克）
  双蒸水（2,925毫升）
2. 搅拌棒
3. 高压灭菌1小时
4. 将烧瓶置于搅拌盘上，低速搅拌，放冷至55°C
5. 一旦很酷，请添加以下内容：
  CaCl 2 2M无菌（3ml）
  无菌硫酸镁（3ml）
  KH 2 PO 4 4M pH 6.0无菌（75ml）
  胆固醇5毫克/毫升在95％乙醇（3毫升）
6. 每个60毫米的平板倒入8毫升
7. 在干燥的状态下放置4°C，或者用2x YT + OP50
  点样
2x YT琼脂（1 L）
1. 将以下内容添加到2升（或更大）的烧瓶中：
  NaCl（5.0克）
  细菌用胰蛋白胨（16克）
  酵母提取物（10克）
  细菌琼脂（15.0克）
  双蒸馏水（最多1升）
2. 搅拌棒
3. 高压灭菌1小时
4. 将烧瓶置于搅拌盘上，置于低速搅拌下，放冷至55°C
5. 每个100毫米的平板倒入18毫升
6. 等待两天，盘子干燥，然后在4°C储存
2x YT培养基（1 L）
1. 添加以下2升烧杯
  胰蛋白胨（16克）
  酵母提取物（10克）
  NaCl（5克）
  用双蒸水填充至1L
2. 添加一个搅拌棒到烧杯中，让搅拌板上的混合物搅拌，直到均匀
3. 倒入1升的瓶子
4. 高压灭菌30分钟
5. 在室温下储存
2x YT培养基+ OP50（1 L）
1. 第1天：使用移液枪头将OP50冷冻的原料分散在2x YT琼脂平板上。将培养板置于37℃的培养箱中，放置一夜。
2. 第2天：使用接种环从2x YT琼脂平板挑取一个菌落，并将菌落移植到1L 2X YT培养基的瓶中。将1L瓶放入37°C的培养箱中，放置一夜。
3. 第3天：将瓶子从37°C的培养箱中取出，并在4°C保存，直到使用
2.2％琼脂糖垫
1. 将以下内容添加到烧瓶中：
  琼脂糖（0.22克）
  双蒸水（10毫升）
2. 微波烧瓶60秒。如果琼脂糖和双蒸水溶液不均匀，再微波30秒
3. 储存在加热块（68°C）的管中
9mM左旋咪唑/ 1x PBS
1. 将以下内容混合在一个管中：
  9毫升10mM左旋咪唑（Sigma-Aldrich）
  1毫升的10倍PBS
2. 在室温下储存
胆固醇（5毫克/毫升）
1. 添加以下500毫升烧杯
  胆固醇（2.5克）
  100％EtOH（475毫升）
  双蒸水（25毫升）
2. 在烧杯中加入搅拌棒，搅拌均匀，直至均匀
3. 将100毫升倒入5个100毫升瓶中（请确认此说明）
1 M CaCl 2 2
1. 在烧杯中，将CaCl 2（73.5g）溶于500ml双蒸水中。
2. 添加一个搅拌棒到烧杯中，让搅拌板上的混合物搅拌，直到均匀
3. 倒入一个500毫升的瓶子
4. 高压灭菌30分钟
1M MgSO 4
1. 在烧杯中，将MgSO 4（123.25g）溶解在500ml双蒸水中。
2. 添加一个搅拌棒到烧杯中，让搅拌板上的混合物搅拌，直到均匀
3. 倒入一个500毫升的瓶子
4. 高压灭菌30分钟
1M KH 2 PO 4 PO 4 6.0
1. 在烧杯中，用双蒸水将KH2PO4（68.05g）溶解在450ml中。
2. 添加一个搅拌棒到烧杯中，让搅拌板上的混合物搅拌，直到均匀
3. 用NaOH调节pH至6.0
4. 用双蒸水加注至500毫升
5. 倒入一个500毫升的瓶子
6. 高压灭菌30分钟

致谢

该协议是由Huynh等人改编的（2016）。这项工作得到了美国显微镜学会（J.M.H）和国家科学基金会（National Science Foundation）授予的3004290（致H.F.）的支持。作者没有利益冲突或利益冲突。

参考

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Fares，H.和Greenwald，I.（2001a）。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）胞吞作用的遗传分析：体细胞摄取缺陷型突变体<遗传学159（1）：133-145。
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Huynh，JM，Dang，H.，Munoz-Tucker，IA，O'Ketch，M.，Liu，IT，Perno，S.，Bhuyan，N.，Crain，A.，Borbon，I.和Fares，H. （2016）。秀丽隐杆线虫的ESCRT依赖性细胞死亡溶酶体贮积模型IV型粘液脂肪病。 202（2）：619-638。
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