材料和试剂

30毫米和90毫米培养皿（格瑞纳生物一国际）
滤纸
单刃刀片（Ted Pella，目录号：121-3）
1.5 microtubes（SSIbio，目录号：1260-00）
卡扣明胶胶囊，大小2（泰德佩拉，目录号：130-19）
封面简介，1号（Fisher Scientific，目录号：12-548A）
显微镜载玻片（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：AA00000112E00MNT10）
Parafilm
棉绒
贴膜
安全手套
Nigella damascena L。种子
Click-iT EdU Alexa 555成像试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，产品目录号：C10338）
胸苷（Sigma-Aldrich，目录号：T9250）
磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH7.2（10x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：70013016）
乙醇
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：62248）
Tris基地
浓盐酸
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
LR白色包埋试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：62662）
注：此产品已停产。
Formvar 1595E（Serva，目录号：21740）
无水1,2-二氯乙烷（Sigma-Aldrich，目录号：284505）
Mowiol 4-88（Sigma-Aldrich，目录号：81381）
甘油（MP Biomedicals，目录号：04800687）
1,4-二氮杂双环 - [2.2.2] - 辛烷（Sigma-Aldrich，目录号：D2522）
注：此产品已停产。
去离子H 2 O
1M Tris-HCl（pH8.5）（见配方1）
多聚甲醛（见方案2）
LR白色丙烯酸树脂（见配方3）
Formvar涂层盖玻片（见配方4）
Mowion安装介质（见配方5）

设备

完美的循环（泰德佩拉，目录编号：13064）
轨道振荡器OS-20（Biosan，型号：OS-20，目录号：BS-010108-AAG）
实验室培养箱TC1 / 20（SKTB，型号：TC-1/20，目录号：1003）
化学通风橱
Ultratome LKB III
配备ORCAII-ERG2相机（Hamamatsu）的荧光显微镜Axiovision 200M（Carl Zeiss，型号：Axiovision 200M）。
注意：为了解卷积，使用了AxioVision 3.1软件（Carl Zeiss）。
pH计
磁力搅拌器加热板MSH-300（Biosan，型号：MSH-300，目录号：BS-010302-OAA）
玻璃或钻石刀
微型离心机MiniSpin（Eppendorf，型号：MiniSpin®plus，目录号：5452000018）

程序

萌发Nigella damascena L的种子。在黑暗中25°С的90毫米培养皿中，用潮湿的滤纸覆盖。
大约需要一个星期的时间才能长到10毫米
染色质标记，使用10毫米长的根。用50μMEdU（EdU是Click-iT EdU Alexa 555成像试剂盒的一部分，根据制造商的建议制备储备液）孵育发芽的种子30分钟。在25°C孵化器内的轨道摇床（50 rpm）上，用10 ml EdU溶液孵育90 mm培养皿。
在200μM胸腺嘧啶核苷中孵育种子30分钟，然后在不同的时间段内在蒸馏水中生长，以允许标记不同的染色体区域。在Nigella damascena L.的情况下，孵育3.5小时足以发现第一个标记的有丝分裂（Kuznetsova等人，2017）。在10毫升胸腺嘧啶核苷溶液或蒸馏水中孵育90毫米的陪替氏培养箱（50转每分钟）安装在一个孵化器在25°C。
使用单刃刀片从10mm长的根部切下长1.0mm的根尖，转移到1.5ml微管并在室温下在0.5xPBS中的2％多聚甲醛中固定1.5h（对于另外的固定方案参见注释1）。
注意：使用化学通风橱处理含有甲醛的化学品。
固定后，在0.5倍PBS中清洗根尖，使用以下步骤使LR白色丙烯酸树脂脱水并渗透：
1. 用0.5x PBS洗3次，每次5分钟。
2. 用50％乙醇清洗根部30分钟
3. 70％乙醇中的标本脱水2次，每次30分钟（可以在4°C下将标本储存在70％乙醇中）。
4. 用LR White和70％乙醇（2：1）混合液（1 ml）渗透1小时。
  对于LR白色/乙醇混合物的制备，将一部分70％乙醇（逐滴加入）缓慢加入两份LR白色中，轻轻旋转试管（否则混合物将变成乳白色）。
5. 在LR White（1 ml）中孵育1小时
6. 在LR White（1 ml）中孵育过夜
7. 在LR白色（1毫升）中孵育1小时。
注意：除非另有说明，否则不要在室温下摇动。
在聚合发生时限制氧与树脂的接触是重要的。达到这个最方便的方法是使用明胶胶囊。将几根（3-4根）根放入胶囊的底部，用LR White填满边缘，然后滑动胶囊的另一半（图1）。

图1.将根管从微管转移到明胶胶囊用于聚合。为了从微管去除根部并转移到胶囊，使用直尖镊子是方便的，并且不会丢弃微管的LR White。
用LR White填充明胶胶囊到边缘。
在55°C下聚合24小时
使用玻璃刀或钻石刀切割组织学样本，使用Ultratome准备半薄切片（100-250 nm）。
使用Perfect Loop在Formvar涂层封面纸上安装半薄切片（请参阅食谱）。
干燥的盖子在37°С的半薄切片滑动2-3小时，以更好地连接部分。
使用Click-iT EdU Alexa 555成像工具包根据制造商的协议检测EdU（见注2）。染色在黑暗中的潮湿室中进行。潮湿的房间是一个90毫米非通风的培养皿，其底部覆盖有石蜡膜。一块潮湿的棉花放在盘子墙附近。将一滴染料溶液置于石蜡膜上，将盖玻片置于这些滴剂上（部分向下）（图2）。这些盘子是用Parafilm密封的。

图2.潮湿房间
在30 mm培养皿中用1μg/ ml DAPI溶液染色DNA 10 min，PBS洗5 min后，用抗漂白剂1,4-二氮杂双环[2.2.2] - 辛烷（DABCO）。
使用野外荧光显微镜和3D解卷积可以获取图像堆栈（图3）。

图3.用EdU染色体标记。 Nigella damascena L的中期细胞。其染色体在晚期S期包括EdU。野外荧光显微镜与3D去卷积。比例尺= 5微米。

笔记

可以使用戊二醛固定（在50mMSörensen缓冲液中的2.5％戊二醛）。但是在这样的固定之后，苍白的自发荧光清晰可见。我们不能推荐这种传统光学显微镜的固定，但可以用于高分辨率显微镜和相关的光学和电子显微镜。
有许多来自不同制造商的荧光团叠氮化物（Molecular Probes，Lumiprobe，Sigma-Aldrich，等等）。用于染色的荧光染料的选择取决于用于图像获取的显微系统。我们的显微镜具有优化的检测Alexa 488和Alexa 555（或具有相似光谱特征的不同荧光染料）的滤光片组。我们更喜欢使用Alexa 555，因为我们使用这种荧光染料获得了更加明亮的染色。

食谱

1M Tris-HCl（pH8.5）
1. 将Tris碱溶于水中（Tris碱121.14g，去离子水〜800ml）
2. 使用pH计，用浓盐酸滴定溶液直至达到正确的pH值。
3. 加去离子水至1000毫升
4. 在4°C储存
多聚甲醛
1. 将2.0g多聚甲醛与100ml0.5xPBS在玻璃中混合，玻璃用箔紧密封闭
2. 用热板在磁力搅拌器上加热溶液直至透明（图4）。不要让解决方案煮沸。
  我们更喜欢用最高温度来加热
3. 然后解决方案将是透明的，有必要从加热器中取出玻璃。稀释的甲醛可以等分，冷冻并储存在-20℃。我们从来没有储存等分超过1个月。每次解冻只有一次是很重要的
注意：使用化学通风橱处理含有甲醛的化学品。

图4.使用带热板的磁力搅拌器溶解多聚甲醛
LR白色丙烯酸树脂
1. 在室温下，将过氧化苯甲酰催化剂（1.998g）加入到LR白色丙烯酸树脂（100ml）中（两种试剂都是LR白色包埋试剂盒的一部分）
2. 催化剂在室温下需要24小时才能完全溶解。在此期间，建议偶尔摇晃活化的树脂混合物。一旦与催化剂混合并充分溶解，树脂必须储存在2-8°C以保持其货架期但不超过9个月
注意：在化学通风橱和安全手套下工作。如果您直接接触皮肤或眼睛，请用大量的水和肥皂清洗患处。
Formvar涂层盖玻片
将3毫克Formvar稀释在10毫升1,2-二氯乙烷中。这种解决方案可以存储在黑暗中的密封玻璃。清洁的盖玻片浸在Formvar的解决方案，并垂直干燥。 Formvar涂层的盖玻片应使用前准备
Mowion安装介质
1. 将1.2g Mowiol 4-88加入到3g甘油中，然后加入3ml去离子H 2 O并在室温下放置2小时。
2. 加入6ml的0.2M Tris-HCl（pH8.5）并加热至50℃，偶尔混合直至Mowiol将被溶解。加入1,4-二氮杂双环[2,2,2] - 辛烷（DABCO）至终浓度2.5％以减少褪色
3. 在离心机中以最大速度离心15分钟，将上清液转移到干净的微管中。
4. 气密微型管中的等分试样可以储存在-20°C。

致谢

这项工作得到了俄罗斯科学基金会（项目14-15-00199）的支持。该协议是从以前的工作改编（库兹涅佐娃等人，2017年）。作者声明不存在可能影响本协议设计和实施的利益冲突或利益冲突。

参考

Kuznetsova，M. A.，Chaban，I. A.和Sheval，E. V.（2017）。可视化大染色体植物中的染色体浓缩植物生物学< / 17>（1）：153。