材料和试剂

手套
8孔，无核酸酶，0.2-ml带帽的薄壁PCR管（SARSTEDT，产品目录号：72.985.002和65.989.002）
针25 G 1.5英寸常规（BD，PrecisionGlide，目录号：305127）
Qubit TM测定管（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：Q32856）。
移液器提示
1.5 ml Eppendorf管
刮刀
70％的乙醇或RNA酶
蛋白酶K（QIAGEN，目录号：19131）
RNasin核糖核酸酶抑制剂（RNase抑制剂）（Promega，目录号：N2611）
UltraPure DNase / RNase free蒸馏水（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：10977015）
Oligo-dT 30 VN引物（从IDT（https://www.idtdna.com/site）订购）：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT 30 VN-3' /> 注意：该寡核苷酸与包含poly（A）尾巴的所有RNA退火。该寡核苷酸的3'端含有'VN'，其中'N'是任何碱基，'V'是A，C或G.两个末端核苷酸是将寡核苷酸锚定到poly（A）尾巴并避免不必要的长腺苷段的扩增。将寡核苷酸溶解在TE缓冲液中至最终浓度为100μM。将此寡核苷酸在-20°C储存6个月。
dNTP混合物（每种10mM）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：R0192）
Superscript II逆转录酶试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：18064014）
LNA修改的TSO（从Exiqon（ http://www.exiqon.com/ ）订购） > 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG + G-3'
注意：在5'末端，这个TSO携带一个通用的引物序列，而在3'末端，有两个核糖鸟苷（rG）和一个LNA-修饰的鸟苷（+ G）以促进模板转换。溶于TE缓冲液中的TSO可以在-80℃下以100μM等分试样储存6个月。避免反复的冻融循环。
甜菜碱（BioUltra≥99.0％）（Sigma-Aldrich，目录号：61962）
氯化镁（MgCl 2，无水）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
Kapa HiFi HotStart ReadyMix（Kapa Biosystems，产品目录号：KK2602）
IS PCR oligo（从IDT（https://www.idtdna.com/site）订购）
5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'
注：该寡核苷酸在RT后的扩增步骤中充当PCR引物。将寡核苷酸溶解在TE缓冲液中至最终浓度为100μM。这种寡核苷酸可以在-20°C下保存6个月。
Agencourt Ampure XP珠（Beckman Coulter，目录号：A63881）
乙醇99.5％（体积/体积）（Kemethyl，目录号：SN366915-06）
Qubit TM dsDNA HS测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：Q32854）
安捷伦高灵敏度DNA试剂盒（Agilent Technologies，目录号：5067-4626）
缓冲液PM（QIAGEN，目录号：19083）
Nextera DNA文库制备试剂盒（24个样品）（Illumina，目录号：FC-121-1030）
QIAquick PCR纯化试剂盒（50）（QIAGEN，目录号：28104）
Phusion高保真PCR主混合物与HF缓冲液，500反应（新英格兰生物实验室，目录号：M0531L）
Tris-HCl pH 8.0（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM9850G）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T9284）
EDTA pH 8.0（Mediatech，目录号：46-034-Cl）
聚山梨酯20，Acros Organics TM（Tween 20）（Acros Organics，目录号：233362500）
RNaseZap（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，产品目录号：AM9780）
测序指标列表（Buenrostro et al。，2015）（参见补充文件）

设备

移液器
微型离心机，带8头PCR管的头部
漩涡
热循环仪
立体显微镜
Qubit 荧光计
Agilent 2100生物分析仪（Agilent Technologies，型号：Agilent 2100，目录号：G2938C）
磁力支架96（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM10027）

程序

警告：RNA很容易被RNA酶降解，在冰上不是很稳定！因此，使用70％的乙醇或去离子水清洗所有表面，经常更换手套，并对所有使用的材料进行消毒。
裂解的样品不应该在冰上保存超过一个小时，因为mRNA会降解注意：

该协议可用于所有幼虫阶段，dauers和线虫的胚胎。
每只虫子都应该使用新的无菌针。

从培养板分离和裂解线虫
注意：在收集蠕虫的当天准备新的缓冲区。
1. 用蛋白酶K制备裂解缓冲液（见方案末尾的食谱），将46.8μl裂解缓冲液与3.2μl蛋白酶K混合，总量为50μl。
2. 从步骤A1将18μl裂解缓冲液与蛋白酶K与2μlRNase抑制剂合并，共20μl裂解缓冲液。
3. 使用蛋白酶K和RNasin核糖核酸酶抑制剂裂解缓冲液裂解蠕虫。
4. 建立一个线虫收集站（图1A）。
5. 用去离子水洗三次线虫：
  1. 要从培养板洗线虫，加入1毫升的水板。
  2. 旋转板三次驱逐线虫。
  3. 用移液管将蠕虫移至1.5 ml Eppendorf管。
  4. 简单地减少。
  5. 去除上清液，用水冲洗1毫升。
  6. 重复步骤A5d和A5e两次或直到水变清。
6. 使用移液器在2μl水中收集一个蠕虫并转移到PCR管的壁上（图1B）。用25号针头切割蜗杆（图1C-1D）（视频1）。
  注意：切割建议所有幼虫阶段。请注意，我们并没有削减胚胎。
  
  视频1
7. 加入2μl裂解缓冲液，含蛋白酶K和RNasin核糖核酸酶抑制剂。
8. 轻敲管混合，并在微型离心机中旋转离心管。
9. 在PCR循环仪上使用以下程序在热循环仪上孵育样品。
  1. 65°C-10分钟
  2. 85°C-1分钟
  3. 4°C
10. 将样品转移到冰上。
11. 添加1μL寡聚-dT VN引物（10μM）和1μLdNTP混合到每个管。轻弹管混合，并下降管。
12. 在72°C孵育热循环仪上的样品3分钟
13. 从热循环仪取样，立即放在冰上。
  
  图1.准备和切割单个线虫以进行裂解A.用于分离，切割和制备RNA-seq的单个线虫的设置的图片。 B.将移液管尖端分离的单个线虫的图片转移至待切割的PCR管中。 C.在2μlDEPC处理的水中的单个线虫的图片。 D.使用25号针头将PCR管中的单个线虫切成两半的照片。在图B-D中，单独的线虫以红色圈出。
Smart-seq2 mRNA的逆转录（RT）
1. 准备逆转录主混合物（RT MM）。（不需要DNase）
2. 向每个PCR管中加入5.7μlRT MM。
3. 在微型离心机中迅速涡旋并旋转。
4. 穿上热循环仪并运行以下程序：
  
  注：停止点。存放样品-20°C。
Smart-seq2 PCR扩增（图2）
1. 将样品放在冰上。准备KAPA HiFi主混音。
2. 加入15μlKAPA HiFi主混合物
3. 穿上热循环仪并运行以下程序：
  
  注：停止点。样品可以无限期地储存在-20°C。
  
  图2.适用于各个线虫的Smart-seq2协议概述。由Picelli 等人修改（2014）。 1.线虫被切割并裂解以释放总RNA。 2. Oligo（dT）在mRNA的3'末端结合聚（A）尾（程序的A部分）。 3. cDNA的第一链由MMLV逆转录酶（RT）合成，其在cDNA的3'端添加非模板引导的胞嘧啶。这些胞嘧啶用于锚定LNA修饰的TSO。然后逆转录酶使用TSO作为模板来完成第一链（程序的B部分）。 4. ISPCR引物与第一链的3'末端退火，允许DNA聚合酶结合并合成cDNA的第二链，随后扩增cDNA（程序的C部分）。 5.纯化双链（ds）cDNA并检查质量（方法的D和E部分）。 6.通过将ds cDNA片段化并连接衔接子序列（步骤F部分）将ds cDNA转座子标记。 7.加标记的双链cDNA被清除，8.连接到样本特定的指标（程序G部分）。
cDNA珠清理
1. 从-20℃取出样品，让它们在室温下静置10分钟。
2. 从冰箱中取出Ampure XP珠子，高速涡旋1分钟。解决方案应该是同质的。
3. 将26μlAmpure XP珠粒等分至1.5ml Eppendorf管中。需要将珠加热至室温大约8分钟。
4. 将样品（约26μl）添加到Ampure XP珠（1：1）中。吸取10次，直到彻底混合。
5. 用Ampure XP珠在室温下在管架上孵育样品8分钟。
6. 制成600μl新鲜的80％无核酸乙醇。
7. 孵育后，将样品置于磁珠架上5分钟。
  注意：珠子将被绑定到感兴趣的cDNA。
8. 使用移液管移除上清液而不干扰珠子。
  注意：将上清液放入旧样品PCR管中，并保存，直至检测到cDNA浓度。
9. 将试管放在磁珠架上，向珠中加入200μl80％乙醇。等待30秒。
10. 用附着在真空管或移液管上的针去除上清液，注意不要弄乱珠子。
  注意：不要让珠子干燥。
11. 重复步骤D9-D10两次。
12. 让磁珠在磁力架上干燥5分钟，打开盖子。监视干燥。
13. 当珠子开始裂开时，从磁铁上取下管子，立即加入17.5微升EB缓冲液到珠子上。吸移10次，彻底混合。该解决方案应该是同质和棕色的。
14. 将样品在室温下在管架上孵育2分钟。
15. 将样品放回磁珠架上2分钟，直到液体变清。在磁力架上收集管中的15μl上清液。小心不要打扰珠子。将上清放入干净的带有标签的Eppendorf管中并置于冰上。
  注意：收集的液体中不应该有棕色的规格。如果您吸取任何珠子，将样品放回珠子管并重复步骤D14-D15。
16. 丢弃磁力架中的管道。
测量cDNA浓度和样品质量检查
注意：根据制造商的指导，校准Qubit荧光计。
1. 用于一个样品的Qubit试剂：
  198微升dsDNA HS缓冲液
  1微升dsDNA HS试剂200x
  1μl的cDNA
  将dsDNA HS试剂，dsDNA HS缓冲液和cDNA加入到Qubit试管中。在微型离心机中迅速涡旋并旋转。
2. 在黑暗中孵育管2分钟
3. 将cDNA样品放入Qubit荧光计。在Qubit屏幕上，选择“DNA”，选择“高灵敏度”，然后选择“读取样本”。选择“读取库存浓度”并将体积更改为“1μl”。记录cDNA浓度（ng /μl）。
4. 按照安捷伦高灵敏度DNA试剂盒的操作说明，在cDNA上运行BioAnalyzer（BA）。
  样品应使用安捷伦高灵敏度DNA试剂盒在BioAnalyzer机器上运行，以生成每个样品中cDNA长度（代表mRNA转录物长度）的分布曲线。如果样品没有降解，您将在500-10,000 bp范围内的片段大小中看到一个清晰的峰，而在较小的片段大小处没有峰，表明由全长mRNA转录产生的全长cDNA（图3A）。如果mRNA转录物降解（可能由于RNA酶污染或RNA处理不当），曲线将显示没有峰或许多小峰（图3B）。
  
  图3. Smart-seq2 BioAnalyzer（BA）图谱的例子A.理想的BA cDNA文件，显示全长转录本，大约1,000bp大的峰，没有PCR引物污染（70bp）。 B.由高度降解的RNA制备的cDNA的BA图谱导致大量的小片段显示出35至300bp的多个峰。
cDNA的标签（图2）
注意：
1. 所有试剂和样品应保存在冰上。
2. 该协议使用标准的Nextera DNA文库制备试剂盒，而不是Nextera XT DNA样品制备试剂盒。
3. 使用缓冲液PM是因为它含有醋酸，因此可以处理样品的pH值。
1. 设置一个加热块到55°C，并加热30μLEB缓冲液。
2. 计算如何从8μl样品中获得20ng的cDNA（见下面的例子）。
3. 在PCR管中放置20ng Ampure纯化的PCR产物。加入EB使体积达到8μl。
4. 在新的PCR管中加入10μl来自Nextera DNA文库制备试剂盒的Tagment DNA缓冲液。
5. 加Nextera DNA Library制备试剂盒中的2.2μlTagment DNA酶1
6. 设置一个新的P20移液器至15μL，并通过上下移液10次混合转座酶和转座酶缓冲液。
7. 将所有混合的转座酶和缓冲液转移到您的cDNA中，然后立即上下移液至少10次，混合均匀。
8. 将样品置于PCR模块上55℃5分钟以启动标记反应。
9. 当样本在PCR模块上时，获得QIAquick DNA清除柱，缓冲液PM和PE。加标签的cDNA将通过该柱以从DNA片段中去除酶。
10. 添加60μL缓冲PM到20μL标记的cDNA。通过上下移液直到溶液变清。
11. 吸取整个量到QIAGEN旋转柱。
12. 将QIAGEN柱在12,470×g的离心机中旋转1分钟。 cDNA将粘附在柱中的白色过滤器上，液体将通过收集管。
13. 将流通物倒入垃圾桶。将色谱柱放回收集管。
14. 加入750μL的缓冲液PE的列。
15. 将QIAGEN柱在12,470×g的离心机中旋转1分钟。
16. 将流通物倒入垃圾桶。将色谱柱放回收集管中。
17. 将QIAGEN柱在12,470×g的离心机中旋转1分钟。
18. 将色谱柱放入新的，清洁标有样品名称的Eppendorf管。
19. 加入30微升温热的EB缓冲液到柱内白色过滤器的中心，注意不要用移液器吸头接触过滤器，或将缓冲液吸到柱壁上。
20. 让列坐1分钟。
21. 在12,470×g的离心机中旋转离心柱1分钟。
22. 取下色谱柱并保持流通。
23. 流通是标记的cDNA。
  注意：在这一步，样品可以交给设备进行测序。如果研究人员添加条形码，请按照以下步骤操作。
接头连接片段的扩增（图2）
1. 在PCR管中加入以下试剂：
2. 将样品放到PCR循环仪上并运行以下程序（Buenrostro et。，2015）：
  
  注：停止点后，样品可以无限期地储存在-20°C。
DNA库珠子清理
按照过程D中所述的步骤进行以下更改：
1. 步骤D3，使用70μlAmpure XP珠（1：1）。
2. 步骤D4，加样（〜70μl）。
3. 步骤D14，加入30μlEB。
4. 步骤D16，收集27.5μl上清液。
DNA文库浓度的测量和样品质量检查
1. 按照程序E中的步骤使用Qubit获取DNA文库浓度。
2. 运行BioAnalyzer来检查图书馆的质量。（可选，但强烈推荐！）
  样品应在BioAnalyzer上运行以检查程序F中标签的质量。完全标记的文库将具有在200bp附近具有清晰峰的BioAnalyzer谱（图4A）。部分加标签的文库将具有150至1,000bp的均一平台的BioAnalyzer谱，并且可能具有小于150bp或大于1,000bp的一些较小的峰（图4B）。
  
  图4.标记和文库制备后的Smart-seq2 BioAnalyzer配置文件示例：一种。已经被完全标记的样品的一个例子显示了大约200bp的一个峰。 B.没有完全标注的样本的例子显示了从150-1,000bp的广泛分布的片段。
库测序
图书馆可以交给测序机构。样品使用双末端43个碱基对读数进行测序。双端测序提高了数据集的质量，使阅读更准确地与参考基因组进行比对。也可以使用单端读取对库进行测序。每个样本应测序至少1000万次，以可靠地检测每一百万个转录本（TPM）。

数据分析

分析Smart-seq2数据
通常将RNA-seq文库测序至10-20万个读段的深度以可靠地描绘目的样品中的基因表达水平。尽管STAR（Dobin等人，2013），Kallisto（Bray等人，2016）和Salmon（Patro等人，2013）等快速可靠的软件。，2017）已经被开发用于分析读取和获得基因/同种型表达水平，高通量数据的分析通常需要计算和数据存储资源超出典型台式或膝上型机器的能力。这些任务需要访问高性能计算集群或诸如Galaxy的在线资源（Afgan等人，2016）。 Galaxy通过用户友好的在线界面提供免费的分析工具和计算/存储资源。对使用任何不同的测序方法产生的数据进行测序可以上传到具有合适分析工具的Galaxy，以获得可解释的结果。在这里，我们提供了一个详细的教程，上载Steinernema carpocapsae RNASeq数据到银河和获得基因表达水平使用三文鱼。

创建一个用户帐户
Galaxy资源的使用需要用户帐户。 Galaxy可以注册一个免费的用户账号。使用任何网页浏览器登录到 usegalaxy.org 。
1. 在网页菜单点击“登录或注册”，然后“注册”。
2. 输入一个有效的电子邮件地址并填写所需的信息。
3. 根据提示登录到Galaxy。
4. 打开发送到您在步骤“2”中提供的电子邮件地址的电子邮件，然后单击提供的链接以激活您的帐户。
上传数据到Galaxy（图5）
1. 使用三文鱼的RNA-Seq分析需要RNA-Seq数据（fastq文件格式）和转录组（fasta文件格式）。 S的转录组。可以从WormBase ParaSite网站下载carpocapsae ，如下所示。
  1. 登录到 parasite.wormbase.org/index.html 。
  2. 点击“下载”。
  3. 在列表中搜索'
  4. 在“全长转录本”下，点击“FASTA”下载 S的基因序列。 carpaocapsae 以fasta格式。
2. 配对结束的 S。 carpocapsae 来自Lu et al。（2017）的RNA-seq数据可以在GEO下载 GSE89961 。
3. 数据可以通过两种方式上传到Galaxy：
  1. 本地从您的计算机：
  2. 从网络访问链接（首选方法）
    1. 在“工具”菜单下的Galaxy网页上，点击“获取数据”并选择“从计算机上传文件”。
    2. 点击“粘贴/取数据”并输入转录组fasta文件的URL。在“类型”下拉菜单中，选择“fasta”。点击“开始”上传文件。
    3. 点击“粘贴/抓取数据”并输入配对结束的fastq文件的URL。确保每个网址都在不同的行上。在“类型”下，下拉菜单中选择“fastq”。点击“开始”上传文件。
    4. 当文件成功上传时，网页右侧历史记录栏中文件名字段的背景变成绿色。
      
      图5. Galaxy界面演示数据分析的B-C部分。用户在“获取数据”上传数据，如左上方（数据分析的B部分）所示。运行鲑鱼进行基因表达定量，如左下方（数据分析的C部分）所示。数据可以从页面右侧的“历史”部分下载（数据分析的步骤C11）。
运行三文鱼（图5）
鲑鱼可以通过比对读数并标准化比对读数来获得RNA-seq数据的基因表达水平，以获得TPM形式的标准化表达水平（每百万转录本）。
1. 在“工具”菜单上的“NGS：RNA分析”下，选择“三文鱼”。
2. 在中间面板的“选择参考转录组”下，选择上传的转录组fasta文件。
3. 在“这是图书馆配对”，选择“配对结束”。
4. 对于“配对1”，选择上传的配对1 fastq文件。
5. 对于“配对2”，选择上传的配对2 fastq文件。
6. 鲑鱼的参数应根据待分析的RNA-seq数据的具体类型设置，这是由所使用的文库制备方案确定的。需要注意的一个重要参数是“指定读取的关联性”。 Lu等人。（2017）RNA-seq数据是非保留的，因此上述参数的值应设置为默认的“不搁置（U）”。另外，在“执行序列特异性偏好校正”和“执行片段GC偏差校正”下，选择“是”。选择其余参数的默认值。有关参数的完整说明，请参阅鲑鱼手册（ https://combine-lab.github.io / salmon / ）。
7. 点击“执行”开始分析。
8. 工作状态显示在右侧“历史记录”面板的一个新字段中。
9. 点击刷新按钮以获得作业的更新状态。提交的作业完成时间取决于Galaxy上的队列大小和上载的读取次数。通常鲑鱼工作完成不到一个小时。
10. 。当作业成功完成后，网页右侧的历史记录面板中的作业领域背景变成绿色
11. 一旦完成，提供基因/同种型名称的标签分隔文本文件，映射到基因/同种型的多个读段和TPM（相对丰度）可以从历史记录栏中的工作领域下载。
12. 步骤11的基因表达结果可以使用通过Galaxy提供的工具进一步分析，例如DESeq2（Love等人，2014）。例如，可以鉴定实验条件/处理之间差异表达的基因/同种型。

笔记

对于胚胎，我们也使用了0.3％的Triton-X作为裂解缓冲液。
在我们的手中，8个样品中的8个通过使用BioAnalyzer的第一次质量检查。
裂解缓冲液必须使用无菌Eppendorf管，刮刀和移液枪头。
每个蠕虫在采集时都应该使用新的枪头
排序不佳，读数少于1百万的样本或与其他生物学重复数据不相关的样本不包含在分析中。

食谱

裂解缓冲液（Shaham et al。，2006）
注意：
1. 裂解缓冲液储液可以在室温下无限期地包裹在箔中。
2. 将Triton-X（100％）分装到1.5ml Eppendorf管中并温热至35℃并按照配方中所述使用。
20μl1 M Tris-HCl pH 8.0
20μlTriton-X（100％）
200μlTween-20（10％）
2μl0.5 M EDTA
1.628毫升无核酸酶水
总共1.871毫升

致谢

我们要感谢Mortazavi和Dillman实验室的所有成员进行有益的讨论。这项工作得到了美国国立卫生研究院新的创新者奖的支持。（NIGMS DP2 GM111100）。作者声明他们没有利益冲突或利益冲突。

参考

阿富汗，E.，贝克，D，van den Beek，M.，Blankenberg，D.，Bouvier，D.，Cech，M.，Chilton，J.，Clements，D.，Coraor，N.，Eberhard，C Gruning，B.，Guerler，A.，Hillman-Jackson，J.，Von Kuster，G.，Rasche，E.，Soranzo，N.，Turaga，N.，Taylor，J.，Nekrutenko， Goecks，J。（2016）。银河平台提供可访问，可复制和协作的生物医学分析：2016年更新。 >核酸研究44（W1）：W3-W10。
Bray，N.L.，Pimentel，H.，Melsted，P。和Pachter，L。（2016）。近乎最优的概率RNA-seq定量。 34（5）：525-527。
Buenrostro，J.D。，Wu，B.，Chang，H.Y。和Greenleaf，W.J。（2015）。 ATAC-seq：全基因组染色质可达性检测方法 Curr Protoc Mol Biol 109：21 29 21-29。
Dillman，AR，Macchietto，M.，Porter，CF，Rogers，A.，Williams，B.，Antoshechkin，I.，Lee，MM，Goodwin，Z.，Lu，X.，Lewis，EE，Goodrich-Blair， H.，Stock，SP，Adams，BJ，Sternberg，PW和Mortazavi，A。（2015）。 Steinernema的比较基因组学揭示了深度保守的基因调控网络。 Genome Biol 16：200。
Dobin，A.，Davis，C. A.，Schlesinger，F.，Drenkow，J.，Zaleski，C.，Jha，S.，Batut，P.，Chaisson，M.和Gingeras，T. R.（2013）。 STAR：超快速通用RNA-seq定位仪生物信息学 29（1）：15-21。
Love M.I.，Huber W.，Anders S.使用DESeq2（2014）对RNA-seq数据的倍数变化和扩散的中度估计。
基因组生物学 15（12）：550
Lu，D.，Macchietto，M.，Chang，D.，Barros，M.M.，Baldwin，J.，Mortazavi，A。和Dillman，A.R。（2017）。活性昆虫病原线虫感染性幼虫释放致命毒液蛋白 PLoS Pathog < 13（4）：e1006302。
Macchietto，M.，Angdembey，D.，Heidarpour，N.，Serra，L.，Rodriguez，B.，El-Ali，N.和Mortazavi，A。（2017）。比较的转录组学> Steinernema 和 Caenorhabditis 单胚胎显示在晚胚胎发生期间直向同源基因表达收敛。 Genome Biol Evolution 9（10）：2681-2696。
Patro，R.，Duggal，G.，Love，M. I.，Irizarry，R.A。和Kingsford，C。（2017）。三文鱼提供了对转录物表达的快速和偏见感知量化。 Nat Methods 14（4）：417-419。
Picelli，S.，Bjorklund，A.K。，Faridani，O.R。，Sagasser，S.，Winberg，G。和Sandberg，R。（2013）。 Smart-seq2用于在单个细胞中进行敏感性全长转录组分析 Nature Methods 10（11）：1096-1098。
Picelli，S.，Faridani，O. R.，Bjorklund，A. K.，Winberg，G.，Sagasser，S.和Sandberg，R.（2014）。使用Smart-seq2从单个细胞获取全长RNA-seq Nat Protoc 9（1）：171-181。
Shaham，S。（2006）。 WormBook：细胞生物学的方法在：WormBook（Ed。）。 C.线虫研究社区。 WormBook 。
Trombetta，J. J.，Gennert，D.，Lu，D.，Satija，R.，Shalek，A.K。和Regev，A。（2014）。制备用于下一代测序的单细胞RNA-Seq文库。 Curr Protoc Mol Biol 107：4.22.21-17。