材料和试剂

异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）
用于重组蛋白表达的中等拷贝质粒pLP8（Plac lacIqKanR，Li和Young，2012）
Bacto胰蛋白胨（BD Biosciences，目录号：211705）
Halt蛋白酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：78425）
RNA酶A（Sigma-Aldrich，目录号：R5503）
DNase I（Thermo Fisher Scientific，目录号：NC9709009）
抗FLAG M2亲和凝胶（Sigma-Aldrich，目录号：A2220）
Poly-Prep色谱柱（Bio-Rad Laboratories，目录号：731-1550）
Micro BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：23235）
Triton X-100
吐温20
胰蛋白胨培养基
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见Recipes）
含Tween 20的磷酸盐缓冲液（PBST）（见配方）

设备

离心机为1.5 ml，10 ml和100 ml体积
高剪切流体处理器（Microfluidics，型号：LV1）或法语压力机

程序

构造一个。表达标记的重组蛋白的大肠杆菌菌株。在该实验中，FLAG标记的焦油由IPTG诱导型质粒表达
转移1ml过夜。大肠杆菌培养物至100ml 1％胰蛋白胨培养基并在30℃下生长。这是鞭毛运动和Tar极性定位的最佳生长条件。在1小时后加入25μMIPTG以诱导用FLAG表位（Tar-FLAG）标记的靶蛋白。生长细胞额外2-3小时。
将细胞沉淀（6,000xg，在室温下5分钟）。在这个实验中，低温影响Tar蛋白的正常极性定位。除非另有说明，否则在以下步骤中使用室温。将沉淀重悬在15ml PBS中。在30℃下振荡孵育1小时，以允许新合成的Tar蛋白定位于杆上
加入60μlHalt蛋白酶抑制剂。加入16μg/ml核糖核酸酶和1.3μg/ml DNA酶（终浓度）。用LV1高剪切流体处理器（Microfluidics）在20,000psi下破碎细胞（破碎只需一秒钟）。立即在冰上冷却样品。
在4℃下旋转（10,000xg 5分钟）以除去未破碎的细胞。
转移10ml含有膜囊泡的上清液到15ml管。加入2ml PBST，倒置管数次混合
加入150μl抗FLAG凝胶珠，然后在冰上孵育1小时，缓慢摇动
将混合物转移至空的Poly-Prep色谱柱。打开色谱柱底部的密封，让液体流动。
用8 ml冷PBST冲洗珠子两次。
盖住色谱柱的底部。加入1ml冷PBST以重悬珠。将混合物转移到1.5 ml管中（此步骤很重要，因为蛋白质和囊泡非特异性地捕获在柱底部的床支撑层中）。
在4℃下旋转（6000xg，1分钟）以使珠粒化。用1ml冷PBST洗两次。
将珠子重悬在85μl1％Triton X-100的PBS溶液中，在室温下孵育10分钟，以溶解内膜。
将混合物离心（6,000xg，在室温下1分钟）。将含有释放的蛋白质的上清液转移到干净的管中用于进一步分析
用1ml含1％Triton X-100的PBS洗涤沉淀。将沉淀重悬于85μl1％SDS的水溶液中，在90°C孵育5分钟，以洗脱所有其他蛋白质，包括FLAG标记的蛋白质。离心并收集上清液（6000xg，在室温下1分钟）。
使用Micro BCA蛋白测定试剂盒确定样品中的蛋白浓度

食谱

PBS
40mM磷酸钠 150mM氯化钠（pH7.4）
PBST
PBS
0.05％吐温20

致谢

这个项目的资金由美国政府提供，并由陆军研究办公室管理，奖号W911NF-10-1-0058。

参考文献

Li，G.and Young，K.D。（2012）。隔离和鉴定新的内膜相关蛋白，其定位于大肠杆菌中的细胞极点。 Mol Microbiol 84（2）：276-295 （本文由Moselio Schaechter在ASM博客中审查小事物：Polar Enchantment，2012年5月7日）