材料和试剂

原子力显微镜金属试样圆盘直径15毫米（ProSciTech，目录号：GA530-15）
莫斯科云母盘，等级V-1直径12.5毫米（ProSciTech，目录号：G51-12）
STKYDOT粘性垫（布鲁克纳米，目录号：STKYDOT）

设备

Cole-Parmer精密镊子套装，不锈钢（Cole-Parmer仪器，目录号：07387-16）
带有纳米级V控制器的多模式8原子力显微镜（AFM）（Bruker Nano，型号：Multimode 8）
轻敲模式AFM尖端（约谐振频率= 300kHz，力常数40N / m）（Bruker Nano，型号：RTESPA-300）

软件

纳米分析软件（Bruker版本1.7）

程序

注意：这里的所有程序都是针对Bruker多模AFM描述的，对于AFM的不同型号和品牌，该协议将需要根据制造商的说明进行调整。

加载样品并设置AFM
现代AFM仪器有多种不同的成像模式可供选择，包括接触模式，非接触模式和轻敲模式。对于这样的软质材料或生物材料，AFM尖端施加在基板上的力最小化是非常重要的，以防止表面被损坏。轻敲模式AFM（TM-AFM）通过中间敲击基板实现这一点，而不是像接触模式AFM那样将AFM悬臂的尖锐尖端拖过基板。由于这个原因，在这些淀粉样原纤维网络上的所有成像应该在TM-AFM中进行。
1. 通过将球形蛋白质（通常是β-乳球蛋白或蛋清溶菌酶）暴露于高温和低pH下，使蛋白质水解成肽片段，制备淀粉样蛋白原纤维网络。随着时间片段自组装成淀粉样原纤维（参见Charnley关于制造这些网络的详细协议，请参见 [2018]）。新鲜制备的淀粉状蛋白原纤维网络可以通过简单的滴铸流程（参见Charnley等人[2018]）沉积在云母上，现在可以使用双重侧面的粘点。小心地将样品安装到AFM上（图1a），确保不会损坏样品装载区域左上方的反射镜。
  
  图1.带有重要对照标记的Bruker Multimode 8 AFM。a）磁性样品架（用于连接磁性AFM柱的样品; b）操作x-y台的旋钮; c）旋钮操纵激光位置; d）旋钮操纵光电二极管的垂直位移; d）控制光电二极管的水平位移; e）旋钮来固定和解除悬臂支架的固定; f）用杠杆调整反射镜对光电二极管的角度; g）激光源的电缆和连接器（确保插入）。
2. 将AFM悬臂安装到其支架上，确保针尖没有损坏（视频1），并且悬臂底座与悬臂支架背面齐平（图2a）。现在将原子力显微镜悬臂支架放入原子力显微镜，确保样品不会太高，导致悬臂撞击样品。确保AFM处于AFM模式（非STM或TM-AFM）。
  
  s视频1
3. 将AFM上的光学显微镜聚焦到悬臂上，并确保它安装得笔直而不是倾斜（图2b和2c）。将相机重新对准云母片的表面。
  注意：请注意，您将注意力集中在最上面的表面，以防止悬臂撞击到基板上。
4. 向上移动样品（或AFM尖端取决于AFM模型），使其靠近云母基底，通过观察AFM尖端与其反射之间的间隔（图2d），可以判断与基底的距离。
5. 将AFM激光光斑聚焦在悬臂上（图1c），使所得到的Sum最大化（对于RTESPA300尖端应该是7左右），但是也要确保激光光斑接近悬臂尖端，而不是明显超过一个边缘（图2e）。
  注意：为了最大化总和，可能需要调整激光位置（图1c）和将激光聚焦到AFM内的4象限光电二极管上的反射镜角度（图1f）。 br />
6. 在将激光点正确定位在AFM悬臂上之后，应该调整四象限光电二极管，使得垂直和水平偏转读数为零（图1d和1dh））。一旦正确调整，应该将AFM切换到TM-AFM模式（使用仪器底座上的开关），如果需要，水平偏转复位为零。
  注意：切换到TM-AFM时，垂直偏转将消失，并被RMS值替换。
  
  a）将RTESPA300悬臂正确安装在标准Bruker多模悬臂支架上; b）正确对准的悬臂的光学显微镜图像; c）对准不佳的悬臂的光学显微镜图像; d）悬臂接近表面的光学显微镜图像，可以通过观察悬臂图像与其反射之间的间隙来监测尖端 - 样品分离; e）当悬臂足够靠近表面时，悬臂和其反射的图像不能相互区分，此时其余的方法应该由软件（使用啮合命令）执行。 >
7. 现在悬臂被正确地安装并且激光对准，所有在成像之前保留的是选择悬臂的共振频率。这可以在AFM软件的设置菜单中完成（在轻敲模式实验预设中）。由于这种成像是在空中进行的，所以自动调谐软件（图3）运行良好，但是用户应该确保自动调谐设置为在正确的频率范围内扫描（200-400 kHz适用于RTESPA300悬臂）目标幅度是足够的（500 mV是一个很好的起点）（见图3）。
  注意：当调整悬臂以找到精确的共振频率时，确保悬臂离表面足够远，以便共振频率不受样品尖端相互作用的影响。
  在自动调谐菜单中单击执行后，软件应正确识别悬臂的谐振频率（可能在RTESPA300悬臂的270-330 kHz之间），并将幅度固定为选定的目标幅度（见图3）。如果软件无法识别谐振频率，或者看起来可疑（即，>从引用的谐振频率±50kHz，和/或不明显是最强的峰值），则步骤A2-A5可能需要重复或悬臂可能会损坏。
  
  图3.悬臂式调谐谐振频率和相移大致类似于上面给出的示例，其中悬臂的引用谐振频率（在这种情况下为300 kHz）附近有一个主峰（±50 kHz））。应特别注意突出显示的参数，起始和结束频率应包括预期的谐振频率（300 kHz），并应选择所需的目标振幅（对于500-1,000 mV的淀粉样原纤维效果良好）。
成像淀粉样原纤维网络
原子力显微镜的最大可用分辨率取决于各种因素（尖端质量，仪器噪声，外部噪声，使用的压电扫描器等等）。该协议使用相对较高分辨率的“e”扫描仪，牺牲了可用的扫描尺寸以提高横向分辨率，因此最大扫描尺寸约为10μm。其他压电扫描仪和其他型号的AFM将允许更大的扫描尺寸（在某些情况下可达数百微米）。
1. 确保AFM悬臂靠近基底界面（图2e），选择扫描速率（〜1 Hz），扫描尺寸（1-10μm）和图像分辨率（512 x 512像素用于出版质量的图像），并从事软件中扫描菜单的悬臂。样品现在将自动移动（最初通过步进电机，后来由压电马达），直到悬臂和基底接触。当悬臂未能与表面接触时偶尔发生错误的接合，如果发生多次，则可能需要重复上述步骤A2-A5或尖端可能被损坏。
2. 一旦悬臂与基板接触，最重要的参数是振幅设定点。振幅设定值近似于尖端施加在样品上的力（较低的电压=施加的较高的力），并自动设定为目标振幅的50％的初始值。一旦开始扫描，振幅设定值可以调整，以便尖端紧密跟踪表面的整体特征。这可以通过查看地形通道中的追踪和回扫线扫描来评估（图4b）。这些应该是完全重叠的，如果它们不是那么应该减小振幅设定点。当原子力显微镜正好跟踪表面（在轨迹线和回程方向）时，获得最佳振幅设定点，但施加在样品上的力最小化（图4）。在这个阶段，如果需要的话，还可以优化驱动幅度和驱动频率，以进一步提高图像的质量。
3. 最后调整积分（IG）和比例增益（PG），使所有通道的噪声最小化。幅度误差通道（默认通道2）最清楚地显示噪声，因此应该使用该通道来微调IG和PG。典型地，随着增益的增加，观察到噪声的降低，直到达到上限，超过该上限，将额外的电噪声引入到图像中。根据经验，PG应该总是比IG大2-3（图4c）。一旦满意图像质量，重新启动扫描，设置文件名称和目录，然后打开捕获以记录图像。好的和坏的扫描参数的例子如图4所示。
  
  图4.淀粉样蛋白原纤维网络的良好（左）和不良（右）AFM成像质量a）准确记录淀粉样蛋白原纤维网络图像的例子; b）跟踪和回扫重叠确认图像质量的扫描线; c）用于记录上述图像的典型扫描设置; d）成像参数差导致原子力显微镜悬臂梁不能紧密跟踪表面，因此模糊的图像; e）由于高振幅设定值，扫描线和扫描线不能很好地重叠; f）非优化扫描设置的例子。

数据分析

基本的图像处理和粗糙度分析
这里我们将详细描述大多数AFM图像所使用的最基本的后期图像处理。注意所有的处理和分析协议都在Nanoscope Analysis软件（Bruker v1.7）中进行，对于其他AFM分析软件，协议可能会有所不同。

在所有地形AFM图像中的图像处理的第一阶段是为了校正与平面的偏差（由于样品未被完全水平安装在AFM中而导致的倾斜）。这是通过Nanoscope软件中的扁平工具（图5）执行的。对于扫描压电式扫描仪总可能距离的一小部分的图像来说，只需校正倾斜的一阶平坦就足够了。在作者的经验中，一阶平面拟合是合适的，总扫描距离的40％，在多模“e”扫描仪的情况下，大约等于4-5微米。对于较大的扫描，可能需要2阶或3阶扁平算法来去除压电元件在其大部分工作距离上行进时发生的样品倾斜和弯曲伪影。

图5. Nanoscope分析软件中展平工具的屏幕截图。 a）由于样品中的倾斜，具有多个伪影的预先平坦的图像。 b）仅有1阶平坦图像去除倾斜。对于较大的扫描，可能需要2阶或3阶平坦化来消除因压电传播其总可能距离的大部分而导致的弯曲效应。
为了计算算术平均粗糙度和均方根粗糙度（在Nanoscope分析软件中分别称为Ra和Rq），粗糙度工具可以通过点击软件中的粗糙度图标来使用（图6i）。作为结果生成的表格显示整个图像（图6ii）以及特定感兴趣区域（图6iii）的Ra和Rq值（如果通过在图像上绘制一个框进行选择）。
还有许多额外的AFM分析工具可以用来提取淀粉样纤维网络的大量信息，如上所述，但是在这里描述它们超出了本协议的范围。有关Nanoscope Analysis中所有可用工具的详细说明，请参阅与软件相关的帮助文件。此外，对于纤维材料，作者推荐免费的软件FiberApp（Usov和Mezzenga，2015）来获得更复杂的统计分析方法。

图6. Nanoscope分析软件中粗糙度分析工具的屏幕截图。 i）粗糙度分析图标; ii）用红色突出显示整个图像的Rq和Ra值; iii）以绿色突出显示图像所选区域的Rq和Ra值。

笔记

获得的图像的质量高度依赖于AFM悬臂的质量和清洁度，对于出版质量的结果，我们总是推荐使用原始悬臂而不是以前用于成像的悬臂。此外，来自不同制造商的悬臂梁的质量可能大不相同，作者指出，由于质量降低到许多悬臂梁不可用的地步，经常从便宜的制造商处购买悬臂梁在经济上是不合理的。

食谱

在Charnley等人（2018）中详细描述了用于制备在此成像的淀粉样蛋白纳米纤丝网络的所有配方。

致谢

这项工作部分在澳大利亚国家制造设施的ANFF-Vic节点进行，澳大利亚国家制造设施是一家根据国家合作研究基础设施战略建立的公司，为澳大利亚研究人员提供纳米和微制造设施。 JG承认澳大利亚政府教育和培训部为奋进奖学金和国家科学基金会研究生研究奖学金项目，编号为DGE-1333468。 NPR和JG在Swinburne科技大学（IC140100023）向ARC生物设备培训中心（IC140100023）表示感谢，感谢他的奖学金（JG）资助（NPR）和主办。 MC承认瑞士国家科学基金会（SNSF）的支持（授予PA00P3_142120和P300P3_154664）。 JG和OGJ承认美国农业部Hatch Act基金进一步资助（IND0-1162）。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

Charnley，M.，Gilbert，J.，Jones，O. G.和Reynolds，N. P.（2018）。淀粉样原纤维网络的制备 Bio-protocol 8（4）： e2733
Dharmadana，D.，Reynolds，N.P.，Conn，C.E。和Valery，C。（2017）。淀粉样蛋白纳米纤维与生物聚集修饰物的分子相互作用：细胞毒性机制和生物材料设计的意义 Interface Focus 7（4）：20160160.
Gilbert，J.，Charnley，M.，Cheng，C.，Reynolds，N. P. and Jones，O. G.（2017a）。利用双峰力谱定量杨氏模量的蛋白纤维和颗粒生物间相 12（4）：041001.
Gilbert，J.，Reynolds，N. P.，Russell，S. M.，Haylock，D.，McArthur，S.，Charnley，M.和Jones，O. G.（2017b）。壳聚糖包被的淀粉样蛋白纤维增加间充质干细胞的脂肪生成。 Mater Sci Eng C 79：363-371。
Jung，J.M.，Savin，G.，Pouzot，M.，Schmitt，C。和Mezzenga，R。（2008）。热诱导β-乳球蛋白聚集体及其与十二烷基硫酸钠的复合物的结构 Biomacromolecules 9（9）：2477-2486。
Lara，C.，Adamcik，J.，Jordens，S.和Mezzenga，R.（2011）。将水解球状蛋白质转化为巨大多分子淀粉样蛋白带的一般自组装机制 > Biomacromolecules 12（5）：1868-1875。
Reynolds，N.P.，Adamcik，J.，Berryman，J.T.，Handschin，S.，Zanjani，A.A.H.，Li，W.，Liu，K.，Zhang，A.and Mezzenga，R.（2017）。促淀粉样变性肽分子突变中晶体与原纤维形成的竞争 >自然通讯 8：1338。
Reynolds，N.P.，Charnley，M.，Bongiovanni，M.N.，Hartley，P.G。和Gras，S.L。（2015）。仿生地形和化学对照细胞附着于淀粉样原纤维生物大分子<
16（5）：1556-1565
Reynolds，N.P.，Charnley，M.，Mezzenga，R.and Hartley，P.G。（2014）。工程溶菌酶淀粉样蛋白原纤维网络支持细胞生长和扩散生物大分子
15（2）：599-608
Reynolds，N.P.，Styan，K.E.，Easton，C.D.，Li，Y.，Waddington，L.，Lara，C.，Forsythe，J.S.，Mezzenga，R.，Hartley，P.G.和Muir，B.W。（2013）。具有淀粉样蛋白原纤维网络定义的表面化学的纳米表面可以控制细胞附着。 > Biomacromolecules 14（7）：2305-2316。
Usov，I.和Mezzenga，R.（2015）。 FiberApp：一种用于跟踪和分析聚合物，细丝，生物大分子和纤维物体的开源软件。 Macromolecules 48：1269-1280。
Wei，G.，Su，Z.，Reynolds，N.P.，Arosio，P.，Hamley，I.W.，Gazit，E。和Mezzenga，R.（2017）。自组装肽和蛋白质的淀粉样蛋白：从结构到量身定做的纳米技术功能 < em Soc Chem Rev 46（15）：4661-4708。