材料和试剂

15和50毫升离心管（康宁公司，产品目录号分别为430791和430829）
1.5ml微量离心管（Corning，Axygen，目录号：MCT-150-C）
90毫米无菌培养皿（Tarsons，目录号：460090）
35mm细胞培养皿（Corning，Falcon ，产品目录号：353001）。
1毫升钝头移液器尖端
康宁 1.2 ml外螺纹聚丙烯低温瓶，锥形底部自立式（Corning，目录号：430658）
FACS管（Corning，Falcon ，产品目录号：352054）
Millex-GP注射式过滤器，0.22微米，聚醚砜，33毫米，γ消毒（Merck，目录号：SLGP033RS）
20毫升和5毫升注射器*
无菌手术刀第20号（HiMedia实验室，目录号：LA771）
0.5-10μl微尖端（Corning，Axygen ，目录号：T-300）
20-200μl移液枪头（Corning，Axygen ®，目录号：T-200-C）
100-1000微升移液枪头（Corning，Axygen ，产品目录号：T-1000-C）
生物危害物一次性废物袋*
塑料烧杯*
0.9％w / v盐水*
抗生素 - 抗真菌药（100x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15240096）
异丙醇*
蒸压蒸馏水
无水乙醇（Merck，目录号：1.00983.0511）
次氯酸钠溶液（Merck，目录号：1.93607.1021）
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS），不含钙，不含镁（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：14190144）
TrypLETM Express酶（1x），不含酚红（Thermo Fisher Scientific，Gibco，产品目录号：12604013）
台盼蓝溶液0.4％（Sigma-Aldrich，目录号：T8154）

流式细胞术抗体（表1）

表1.流式细胞术抗体

S. No.	Antigen (CD marker)	Antibody	Manufacturer	Dilution
1.	CD73	Anti-Human CD73 PE	BD, BD PharmingenTM, catalog number: 550257	1.5 µl in 50 µl of cell suspension
2.	CD90	Anti-Human CD90 PE	BD, BD PharmingenTM, catalog number: 555596	1.5 µl in 50 µl of cell suspension
3.	CD105	Anti-Human CD105-PE	R&D Systems, catalog number: FAB10971P	1 µl in 50 µl of cell suspension
4.	CD34	Anti-Human CD34	BD, BD PharmingenTM, catalog number: 550761	1 µl in 50 µl of cell suspension
S. No.		Isotype antibody	Manufacturer	Dilution
1.		IgG1, kappa	BD, BD PharmingenTM, catalog number: 550617	1µl of 1:16 dilution in 50 µl of cell suspension (for CD73 and CD34) 1.5 µl in 50 µl cell suspension for CD90
2.		IgG1	R&D Systems, catalog number: IC002P	1µl of 1:16 dilution in 50 µl cell suspension

KnockOut TM D-MEM高葡萄糖无谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：10829018）
注意：DMEM-F12或DMEM，高葡萄糖也可用于代替KnockOut TM D-MEM（Nekanti等人。，2010）。
L-谷氨酰胺（200mM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25030149）
合格的胎牛血清（FBS）间充质干细胞（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：12662029）
注：FBS的来源，等级和批号在MSC文化建设中起着至关重要的作用。
青霉素 - 链霉素（10,000U / ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140148）
磷酸盐缓冲盐水片（Sigma-Aldrich，目录号：P4417）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）
鞘液（BD Biosciences，BD FACS Flow TM，目录号：342003）
MSC隔离介质（见食谱）
MSC生长介质（见食谱）
1x无菌磷酸盐缓冲盐水，pH值7.4（见食谱）
MSC冷冻混合物（见食谱）

*注意：此项目可以从任何标准公司订购

设备

层流罩*（EuroClone，型号：S @ feflow 0.9，目录号：LD80000）
手术工具，包括手术刀支架，镊子（大小），尖头剪刀
培养箱（BINDER，型号：C 150 CO 2培养箱，目录号：9040-0078）
离心机5810 R（Eppendorf，型号：5810 R，目录号：5811000320）
血细胞计数器深度0.1mm *（Rohem Instruments Private limited， http://www.sciencecorner.co.in/ Rohem.php ）
Frosty TM冷冻容器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：5100-0001）
-20°C冰箱*（Celfrost，型号：BSF 150）
-86°C立式超低温冷冻机（Revco值，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：ULT-1386-3）
液氮罐（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Model 8031）
流式细胞仪（BD Biosciences，BD FACSCalibur TM）
倒置显微镜*（尼康仪器，型号：Eclipse TS100）
冰箱*（SAMSUNG，型号：RT31,2007）
2-20μl单通道可变移液器*（Eppendorf，型号：Research ®plus，产品目录号：3120000038）
20-200μl单通道可变移液器*（Eppendorf，型号：Research ®plus，产品目录号：3120000054）
注意：胰蛋白酶可以用作TrypLE的替代品。 TrypLE是一种无动物源的重组酶，对干细胞温和，从而保护细胞的表面蛋白。
向细胞中加入1ml温热的新鲜MSC生长培养基，并将它们转移到15ml离心管中，并在室温下以500gxg离心2分钟。
吸出培养基，加入500微升温暖新鲜的MSC生长培养基的细胞沉淀，悬浮颗粒。将一小份细胞悬液与等体积的台盼蓝混合，并用血细胞计数器计数活的（非蓝色）细胞。
作为下一步，在35mm组织培养皿或任何合适的细胞培养皿中的2ml温热的新鲜MSC生长培养基中密度为5,000个细胞/ cm 2的种子WJ-MSC。 />
培养他们72小时或直到细胞70-80％汇合。
中间不需要更换。
使用TrypLE分离细胞，为下一个细胞计数和种子，重复步骤B2-B6。

注意：在胰蛋白酶消化或细胞分离开始之前，TrypLE，MSC生长培养基和DPBS需要预热至37°C。

WJ-MSC的冻结和恢复
1. 一旦WJ-MSC为70-80％汇合，按照步骤B2用250μlTrypLE分离。
2. 向细胞中加入1ml新鲜的MSC生长培养基并将其转移至15ml离心管中。取等分部分进行计数，并在室温下将剩余的细胞在500×g下离心2分钟。
3. 吸出上清液并以约2×10 6细胞/ ml直接悬浮于冷冻培养基中。
4. 将150-200μl细胞悬液分装到低温瓶中，并将低温瓶转移到含有异丙醇的Mr. Frosty TM冷冻容器中。
5. 将Frosty TM冷冻容器放置在-80°C冷冻箱中约24小时，然后将低温瓶转移到液氮罐中进行长期储存。
6. 为了复苏，从液氮罐中取出冷冻WJ-MSCs的冷冻小瓶，立即转移到含有37℃水的烧杯中。
7. 一旦细胞悬浮液融化，在层流罩内加入1ml温热的新鲜MSC生长培养基到低温小瓶中的细胞悬液中，并将内容物转移到15ml离心管中，该离心管含有3-4ml另外的温热的新鲜MSC生长中等。
8. 将细胞在室温下500×g离心2-3分钟以洗去DMSO。
9. 吸出上清液，并在0.5毫升新鲜温暖的MSC生长培养基重悬细胞沉淀。计数活细胞，并在2毫升温热的新鲜MSC生长培养基中的35毫米组织培养板上平板2-3×10 5个细胞。
  注意：在MSCs解冻和复苏过程中，细胞以更高的密度接种，以最大限度地恢复。
10. 将培养皿转移到CO 2培养箱中，第二天用2ml新鲜的MSC生长培养基代替培养基。
11. 复苏和铺板48小时后，用TrypLE和种子分离细胞用于下一次传代。
流式细胞仪免疫分型
1. 在第4-5代采取WJ-MSC。用TrypLE分离它们并按照步骤B2-B4计算单元格编号。
2. 使用冰冷PBS将收获的细胞洗涤1-2次，在600×g离心2分钟。
3. 弃去上清液并以2×10 6细胞/ ml悬浮于PBS中的细胞。
4. 在每个预先标记的5ml FACS管中分配1×10 5个细胞或50μl细胞悬液。
5. 按照表1添加PE或FITC标记的抗体，并在冰上孵育45-60分钟。小鼠同种型抗体可以作为对照（图4）。
  
  图4.流式细胞术分析显示的WJ-MSC的免疫分型。打开的直方图表示背景信号，而阴影直方图表示与所示抗体的阳性反应性。 WJ-MSC对CD73（A），CD90（B）和CD105（C）呈阳性，对CD34（D）呈阴性。

数据分析

分析从人脐带分离的WJ-MSC，在第4-6代分析表面标志物表达谱。在BD FACSCalibur流式细胞仪上至少获得10,000个事件，并使用BD Cell Quest Pro软件分析结果。已知培养的MSC对CD73，CD90和CD105的表达强烈表达，对于CD34，CD45，HLADR等的表达是不利的。所有分析均针对与PE缀合的小鼠IgG同种型抗体温育的对照细胞进行标准化。本议定书提供了第5代WJ-MSC文化的代表性数据。然而，类似的结果已经从多个独立的WJ-MSC培养物中获得（Himal等人，2017）。

笔记

对于MSC隔离，绳索通常从健康的捐助者收集。
收集后，应将脐带运送到实验室并尽快处理，最好在一小时内完成。
根据绳索样品，WJ-MSC可能需要6-14天从绳索中出来。
预热到37°C的温度，并只给细胞添加温暖的媒介。
所有的塑料制品如微量离心管和吸管尖端以及手术器械在使用之前均经过高压灭菌处理，然后用于细胞培养。
可以使用血细胞计数器计算细胞浓度，因为四个角区域中的活（非蓝色）细胞总数/ 4×稀释倍数x 10,000 = No.细胞/ ml。

食谱

MSC隔离介质
DMEM KO
2 mM谷氨酰胺
1x抗生素 - 抗真菌剂
10％MSC FBS
通过0.22微米注射器过滤器过滤消毒
在4°C储存，2周内使用
MSC生长培养基
DMEM KO
2 mM谷氨酰胺
1x青霉素 - 链霉素
10％FBS
通过0.22微米注射器过滤器过滤消毒
在4°C储存，2周内使用
1x无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4
将两片PBS溶解在400毫升蒸馏水中
通过高压灭菌来消毒
在4°C储存。在1个月内使用
MSC冷冻混合物
90％FBS
10％DMSO
通过0.22微米注射器过滤器过滤消毒
在4°C储存。 2周内使用

致谢

这项工作得到了IISER-Kolkata和印度DST SERB的资助。我们感谢CSIR，印度Umesh Goyal先生的奖学金。我们感谢Pritam Saha先生和Tamal Ghosh先生分别协助细胞培养设施维护和流式细胞术数据分析。我们感谢Kalyani的Aastha的Jayanta Chatterjee博士慷慨地为我们提供人类脐带样品。该协议已根据我们以前的协议（Venugopal et al。，2011）进行了改编。作者声明不存在潜在的利益冲突。

参考

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Caplan，A.I。和Correa，D。（2011）。 MSC：一家受伤的药店干细胞 9（1）：11-15。
Caplan，A.I。和Sorrell，J.M。（2015）。停止免疫系统的MSC窗帘。 Immunol Lett > 168（2）：136-139。
El Omar，R.，Beroud，J.，Stoltz，J. F.，Menu，P.，Velot，E.和Decot，V.（2014）。脐带间充质干细胞：基于间充质干细胞治疗的新金标准？ Tissue Eng Part B Rev 20（5）：523-544。
Hass，R.，Kasper，C.，Bohm，S.和Jacobs，R.（2011）。人类间充质干细胞（MSC）的不同人群和来源：成人和新生儿组织 - 派生的MSC。通讯信号 9：12.
Himal I.，Goyal，U.和Ta，M.（2017）。评估沃顿公司果冻衍生的间充质干细胞的存活，迁移和伤口修复标志物的表达缺血性应激的条件。干细胞内容 2017：5259849.
Kwon，A.，Kim，Y.，Kim，M.，Kim，J.，Choi，H.，Jekarl，D.W.，Lee，S.，Kim，J.M.，Shin，J.C。和Park，I.Y。（2016）来自围生期组织的间充质基质细胞的组织特异性分化潜能 Rep 6：23544.
本研究的主要内容如下：1，研究方向：动物实验，动物实验，动物实验，动物实验，动物实验，动物实验，动物实验， XZ（2016）。人类脐带间充质基质细胞可改善猪模型的左心室功能，灌注和重塑慢性心肌缺血的干细胞研究 5（8）：1004-1013。
Nekanti，U.，Rao，V.B.，Bahirvani，A.G.，Jan，M.，Totey，S.and Ta，M.（2010）。沃顿商学院果冻衍生的间充质干细胞的长期扩增和多能标记物阵列分析干细胞开发 19（1）：117-130。
Troyer，D.L。和Weiss，M.L。（2008）。沃顿商学院的果冻来源的细胞是一种原始的基质细胞群体。干细胞 26（3）：591-599。
Venugopal，P.，Balasubramanian，S.，Majumdar，A.S。和Ta，M。（2011）。无异种培养下沃顿果冻衍生的间充质干细胞的分离，鉴定和基因表达分析条件。干细胞克隆 4：39-50。
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