材料和试剂

果蝇小瓶（宽，K-树脂）（Dutscher，目录号：789002）
Flugs 蝇塞，塑料小瓶（宽）（Dutscher，目录号：789035）
Omniflex单丝钓鱼线莎士比亚（6磅测试，直径0.23毫米）（Zebco，塔尔萨，美国）
培养皿（直径10厘米）（SARSTEDT，目录号：82.1473）
飞股票
Chromsome，Bloomginton股票中心编号：
1118 （X，BL 6326）
W *; ppk-Gal4（X，3，BL 32079）
w *; UAS-TNTE （X，3 ，BL 28997）
W *; TrpA1 1 （X，2 ，BL 36342）
琼脂神户我（卡尔罗斯，目录编号：5210.4）
琼脂平板（见食谱）
飞食物（见食谱）
1. ＆nbsp;琼脂（字符串）（GewürzmühleBrecht，Eggenstein，目录号：00262）
2. 玉米粉（Davert，Newstartcenter，目录号：17080）
3. 大豆粉（Davert，Newstartcenter，目录号：46985）
4. 啤酒酵母（地面）（GewürzmühleBrecht，Eggenstein，目录号：03462）
5. 麦芽糖浆（MeisterMarken-Ulmer Spatz，莱茵河畔宾根，目录号：728985）
6. 糖蜜（糖蜜）（Grafschafter Krautfabrik，Meckenheim，目录编号：01939）
7. 尼泊金（4-羟基苯甲酸甲酯）（Sigma-Aldrich，目录号：54752-1KG-F）
8. 丙酸（Carl Roth，目录号：6026.3）

设备

刷子（规格1，Boesner，型号：Da Vinci Nova Serie 1570，产品目录号：D15701）
镊子（Dumont，＃3）（精细科学工具，目录号：11231-30）
光源（白光）LED Schott KL 1500 LCD（Pulch und Lorenz，产品目录编号：150.200）
制造商：SCHOTT，型号：KL 1500 LCD。
SZX7立体显微镜（奥林巴斯，型号：SZX7）

软件

Origin Pro 9.0（OriginLab，Northampton，USA）或类似的统计分析

程序

所有的飞行物保持在25℃和70％湿度下，在标准飞行食物上进行12小时黑暗/光照周期。在产蛋后（AEL）96小时（小时），使用3日龄幼虫进行所有实验。为了确保所有幼虫的年龄大致相同，产蛋时间限制在4-6小时。在25℃，70％湿度和12小时光照/ 12小时黑暗周期的标准飞行食物中提高实验杂交。
准备你的基因十字架前两天准备约。 20-30个处女和每个10-15个男性（如果你使用弱基因型更多）。 2天后，将苍蝇转移至新鲜食物瓶中，在25℃定时产卵4-6小时（图1A）。将成年果蝇转移到新鲜的小瓶中（在同一天或第二天进行另一轮分娩）。原始小瓶维持在25°C直到96±3小时AEL。所有幼虫应该在第三龄期（L3）觅食阶段，并且还没有离开食物（图1B）。
注意：准确的分期很重要，因为120 h AEL后幼虫的伤害性反应会减少，这可能是由于向徘徊阶段过渡和蛹化准备所致。食物中幼虫的密度也会影响分期：太少的动物不能有效地处理食物，而幼虫过多会导致食物竞争，这两者都会影响发育进程，并会扩大幼虫种群的发育阶段。在使用具有延迟发育的突变动物的情况下，分期必须相应地调整（通过动物大小或蜕皮计数嘴钩牙进行分期）。

图1.正确的分期和幼虫密度。：一种。显示使用的小瓶尺寸的合适胚胎数量的照片（4-6小时内放置大约100-150个胚胎）。 B.在96小时AEL，幼虫应该已经很好地处理了食物，仍然处于觅食阶段。
工具准备
1. 切割全长单丝钓鱼线（莎士比亚，6磅测试，直径0.009英寸[0.23毫米]）长度为18毫米。将10mm的牙签连接到牙签上，使得8mm的牙签从牙签的末端突出（图2A）。
2. 通过使用它来平衡纤维的力量，直到看到钓鱼线弯曲。记录力（单位为克），并将测得的克乘以9.81倍，转换为毫牛顿（mN）。通常，这段长丝产生45-50mN的力（图2B-2D）。改变灯丝长度会改变机械力（时间越长，力越小），如果要测试不同的力，这可能是可取的。幼虫的伤害性反应的概率随着施加的力从30至120mN而增加（Kim等人，2012; Almeida-Carvalho等人，2017）。
3. 检查立体镜下的灯丝，确保没有锋利的边缘，这可能会伤害动物。穿刺体壁会导致行为反应改变。
  
  图2.工具准备和校准。：一种。根据上述说明制备的8毫米长丝连接到牙签上。 B-d。校准灯丝：灯丝应该施加45-50mN（4.59-5.10g）的力。 B.重复按压灯丝应产生可比较的力（这里为46±5 mN）。 B”。如图所示（图45-60），通过正确的压力和灯丝弯曲成直角可获得可重复的力。 C'。太小的压力和/或错误的偏转角度会导致较小的力。 C'。
  
  太大的压力和/或错误的角度会导致太大的力量
在2％琼脂平板上分配2毫升dH 2 O 2以形成薄水膜，使动物能够自由爬行并执行其滚动行为。没有水，幼虫不能充分移动，不会显示一致的行为反应。
通过在dH 2 O中洗涤来准备10-20个分级的幼虫以去除任何残留的食物，并使用刷子将它们轻轻地放在琼脂平板上（图3A-3D）。

图3.机械伤害性测定的制备。 A和B.通过使用刷子将10-20个阶段的3龄幼虫轻轻放置在10cm 2的琼脂平板上来制备测定。 C.为了一致的行为反应，需要2毫升薄水膜（用于说明的彩色洋红色）。 D.将具有测试动物的琼脂平板置于具有光源的立体镜下。 E.一只3龄幼虫的插图。盒装区域表示腹部片段A3-A6的背外侧区域，其应该以针对所选择的力（30-120mN）校准的丝线为目标。 F-小时。显示了在幼虫上正确和不正确放置丝线的例子。 F.正确放置在背外侧的A3区域。 G.错误的放置与动物远离灯丝导致刺激角度不佳。 H.通常不会引起滚动行为的前段细丝放置。
通过在背侧（腹节4,5或6）快速压下幼虫约1秒钟来提供机械刺激。快速释放允许幼虫执行逃生行为。
停顿2-3秒后，重新对相同的幼虫施加刺激。
根据Hwang等人的评分表，立即对反应进行评分。（2007）：没有反应，停止，停止和转向（非伤害性反应）或滚动（伤害性反应）;此外，我们引入了弯曲评分以获得不会导致滚动的不完全伤害性反应（C形同时抽动性头部和尾部运动）（反应分类：1 =无反应，2 =停止，3 =停止和转动，4 =弯曲，5 =滚动）。如果响应机械刺激（图4A-4D;视频1和2）发生沿着身体轴线的至少一个360°旋转，则对正面滚动响应进行评分。
注意：为了发展精确的力量并向动物施加正确的力量，实验者应该在天平上练习正确的动作。用牙线拿住牙签，并以45-60°的角度压下牙线直至弯曲，每次都会产生一致的力。与对照动物一起练习将进一步确保一致的结果。
50-70％的动物在第二次刺激后应该会出现滚动逃跑行为

图4.对机械伤害性刺激的行为反应。：一种。机械刺激后伤害性滚动反应的蒙太奇。请注意，幼虫在主气管后方沿着身体轴线执行完整的360°滚动。 B.部分伤害性反应（“弯曲”）的蒙太奇导致C形身体弯曲，但没有完整的360°滚动。 C.停止和转动响应的蒙太奇（停止并且至少45°改变方向）。 D.停止响应的蒙太奇（移动方向没有重大变化）。

视频1

视频2

数据分析

机械伤害性反应的统计学差异可以使用χ2检验来计算，这允许比较2种基因型之间的分类数据（例如 2 / ，控制与 TrpA1 1 ）。仅区分伤害性和非伤害性行为允许使用2×2列联表提供使用 2 检验的最高统计功效拥有1个自由度。可根据以下公式确定： 2 ：

O：观测值，E：预期值。
χ 2 - 测试需要动物的实际数量，因为它无法计算比率，百分比或频率。大多数统计程序（Origin Pro，SigmaPlot，Prism，SAS，Statistica，R）可以用来计算 2 2 并计算统计显着性。
注意：在应该比较两种以上基因型的情况下，应该进行适当的多重比较统计显着性的校正，例如Bonferroni校正因子（如果p