材料和试剂

双面胶带（Scotch 12 x 6.3 mm分液，永久性，清洁）
单面胶带（透明胶带Scotch 19 x 33 mm）
叶子扫描的模板表
外盆（APTE Society， http://www.apte.fr/ ）
内部穿孔锅（用Dremel 4000穿孔的外锅手）
锅标签（点标签，软塑料1.3 x 6厘米，BIER： http：
//www.fournitures-horticoles.com/magasin/catproduits.php?idgdf=9 ）
木牙签
显微镜幻灯片（Knittel玻璃76 x 26毫米，Starfrost）
铅笔
细永久性标记（Staedtler永久，Lumacolor）
用于土壤干燥的圆柱形容器（50 x 50 mm，Servilab，目录号：8668770）
用于植物组织干燥的纸袋（7 x 12厘米： http： //www.beaumont-group.fr/produit/kraft-blanchi-frictionne-neutre-2/ ）
手术刀（Swann-Morton，碳钢外科手术刀）
（S Murray 不锈钢制表匠钳11厘米，Fisher Scientific）
甲。 thaliana 种子
农业土壤（来自法国蒙彼利埃附近的Mauguio市：N 43 37'01“，E 4 00'33”）
堆肥（Neuhaus N2）
清除指甲油（美宝莲纽约，快递完成40）
磷酸二氢铵（H 2 PO 4 4 NH 4）（VWR，目录号：21305.290）
硝酸钾（KNO 3）（VWR，目录号：26869.291）
Fe（E.D.D.H.A）（SEQUESTRENE 138 FE 100 SG）
硝酸（HNO 3）52％（VWR，目录号：20412.362）
硼酸（H 3 BO 3）（Merck，目录号：1.00165.0100）
硫酸锰（II）一水合物（MnSO 4•H 2 O）（VWR，目录号：25303.233）
硫酸铜（II）五水合物（CuSO 4•5H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C2857-250G）
注意：此产品已停产。
硫酸锌七水合物（ZnSO 4•7H 2 O）（Avantor Performance Materials，J.T.Baker，目录号：4382-01）
钼酸铵四水合物，（NH4）6Mo7O24•4H2 / 2 > O（Sigma-Aldrich，目录号：A7302-100G）
营养液（见食谱）
微量元素解决方案（请参阅食谱）

设备

PHENOPSIS表型分析平台（图1）
1. 成长室
2. 机器人手臂（由Optimalog定制： https://www.optimalog.com/phenopsis ） >
3. 精密天平（Precisa，型号：XB620C）
4. 浇水管
5. RBG相机（带有Computar Varifocal Megapixel M3Z1228C-MP（CBC，Computar，型号：M3Z1228C-MP），12-36mm，C型变焦镜头的Prosilica GC1600（Allied Vision Technologies，型号：PROSILICA GC 1600））
6. 控制电脑（戴尔）
物理阶段符号的笔记本电脑（HP ProBook 650 G1（HP开发，型号：HP ProBook 650 G1），Intel Core i3-4000M双核，8 GB 1600 DDR3L 2DM）
桌面扫描仪（爱普生，型号：爱普生完美4990照片）
用于图像分析的台式机（HP Compaq Pro 6300 MT PC +（HP开发，型号：HP Compaq Pro 6300微型立式机）Intel Core i5-3470 3.2 G 6 M HD 2500 CPU，GB DDR3-1600 DIMM（2 x 4 GB）RAM + 250 GB 7200 RPM 3.5硬盘，AMD Radeon HD 7450 DP）
带笔的平板电脑显示器（Wacom，型号：Cintiq 22HD）
带相机附件的立体显微镜（Leitz DMRB，Manta G-201B相机）
绿色LED灯（灯泡LED GU10点1 W = 10 W绿色）

图1. PHENOPSIS表型分析平台。：一种。生长室概述;公元前。带RBG相机和浇水管的机器人手臂可见; D.精密天平; E.控制平台的Optimalog软件截图。

软件

Microsoft Excel
ImageJ v1.51（ https://imagej.nih.gov/ij/ ）（Schneider > et al。，2012）
PHENOPSIS ImageJ宏（ http://bioweb.supagro.inra.fr/phenopsis/MacroImageJ.php ）
应用于自动控制：
OPTIMA PLC软件（ https://optimalog.com/index.php?q=optimaplc_presentation ）
相机控制：ProsilicaGigE（RGB Camera，Allied Vision）;可选：ThermaCAM研究员（IR相机，Flir），ImagingWin（荧光相机，Walz）
注意：所有软件都可以通过Optimalog与Phenopsis一起使用。
R v3.4.1（ https://www.r-project.org/ ）
用于监测环境条件的软件：
Campbell Logger Net（ https://www.campbellsci.com/loggernet ）

程序

准备实验
1. 设计实验：实验条件（空气条件，如果考虑光周期和水分亏缺处理），实验持续时间，组织收获，平台中植物的总数以及生物学重复次数。一个示例实验可以是：21。在三种浇水方式（充分浇水，中度和重度缺水）中生长的拟南芥基因型，每种浇水条件下每基因型8个生物学重复。使用四个实验模块，每个模块会有两个重复项目（图2）。＆nbsp;
2. 创建一个随机化的实验设计，例如使用自定义的R脚本（图2）。盆坐标随机化是可取的，以减少生长室中位置的影响，这可能显着影响结果，例如生长速率和开花时间。可以将编号分配给试验室的不同区域以测试罐位置效应。将数字分配给底池并将数据输入到电子表格。
  
  图2.用PHENOPSIS进行的具有21 A的特定实验的示意性随机实验设计。拟南芥基因型，3种浇水方式和每种基因型在每种浇水条件下的8种生物学重复。每个点对应一个盆。形状对应于浇水制度和颜色与基因型。黑线将PHENOPSIS生长室中的托盘分开，灰色/白色阴影表示4个块。随机化可以减少生长室中壶的位置影响，块可以用来研究这种影响。
3. 准备用胶带标记的两个系列盆（内部和外部）。如果需要，内盆用穿孔加长孔以增强土壤干燥过程（图3）。
  
  图3. PHENOPSIS实验中使用的花盆。内盆（左）具有延长的孔以增强土壤干燥（在盆的表面上可以看到两条线）。所有内锅的孔几乎完全相同，因此土壤干燥动态的差异很小。外盆（右）没有穿孔。资料来源： http://bioweb.supagro.inra.fr/phenopsis/ 。
4. 称重外部（）和内部）花盆。
  在电子表格中输入两个空罐的权重。
5. 准备底物：将50％的农业土壤与50％的堆肥混合。
  注：这种底物专门用于缺水实验，因为它为此目的提供了最佳的保水性。其他基材可用于其他类型的实验。
6. 将内罐置于外罐中，并用混合基材填充内罐，用底板称重罐（ Total ），并将该重量输入到电子表格中。
  每10盆收集一个小土壤样本（约10克）并称重（ wet ）。
7. 在80°C下干燥土壤样品3天。
8. 用10毫升营养液冲洗土壤表面（见食谱），以获得更好的种子吸收。
9. 播种约5微米。使用湿牙签将拟南芥种子播种到土壤表面，并在黑暗中将盆放入生长室（20.5℃和70％相对空气湿度）两天。
10. 将盆转移到PHENOPSIS生长室并调整环境条件（蒸气压不足，光周期，温度，PAR [最大值：200μmol]）。
11. 每天用去离子水喷洒所有盆中的土壤表面3次，直至萌发。
12. 测量土壤样品的重量（ s dry ）并将它们包含在电子表格中。每个土壤样本将代表10个盆。按照以下步骤计算基材的初始 SWC ：
13. 计算湿（ PS wet ）和干（ ps ）土壤重量如下：
14. 使用单个（目标单个）和双精度来计算期望的 SWC （目标 double ）。这里将SWC 定义为g H 2 -1 干土。
  
  如果您计划应用缺水处理，请计算充水条件和缺水条件下的目标重量。
实验管理
1. 在数据库中声明实验（PhenopsisDB， http://bioweb.supagro.inra.fr/phenopsis/ < / A>）。包括关于种子库存，浇水制度和实验的其他细节的信息。
2. 请注意每个锅的发芽日期。
3. 发芽后，调整Optimalog软件中的浇水条件。该软件控制机器人手臂的功能，包括罐体重量，浇水和成像的测量以及白天的周期。浇水可以使用电子表格进行编程，其中计算的锅重量用于期望的条件。每天设置1-2次称量/浇水周期。将目标 SWC 设置为0.35 g H 2 <-1> 干土。
  
  图4. zenithal玫瑰花图像示例 A.未处理的图像 A。 thaliana rosette; B.使用自定义ImageJ宏来处理图像，该图像将颜色阈值应用于图片。生成的二进制掩码是基于绿色像素创建的。资料来源： http://bioweb.supagro.inra.fr/phenopsis/ 。 >
4. 在prosilicaGigE软件中调整天顶成像的属性。
  在生长室中打开灯后，每天对机器人进行编程以拍摄一张照片。（图4）
5. 每周进行三次物候阶段标记。符号采取 ca。 2小时2人，504盆，即，一个在室内看着植物的物候阶段，另一个在笔记本电脑上注意。应注意关键的发育阶段（Boyes等人，2001年），以及每个植物的叶片数量。符号最好存储在电子表格中。
6. 在每个盆中分别确定的4叶阶段，移除过量的植物，每盆留下一个健康的植物。
7. 如果实验涉及不同的 SWC 治疗，目标体重应该在外观上适当调整（ single ））第一片真叶，外层盆应在土壤干燥期内除去。到达所需的 SWC 后，重新引入外罐并将目标重量调整为 double 。这需要为每个罐子单独完成。
8. 在先前指定的生长阶段收获植物组织。如果考虑代谢组学和转录组学分析，建议在一天的特定时间收集组织以避免日间波动。夜间收获可以在绿光下完成，以避免激活光合作用过程和诱导光依赖性基因表达。
生物量分区和叶扫描
1. 去除开花茎并在土壤表面附近切割莲座。测量莲座鲜重（ FW R ）。
2. 将培养皿中的玫瑰花瓣放在培养皿中的湿纸巾之间，并将培养皿置于冷室中24小时。
3. 用纸巾小心地去除花环上的水滴，然后测量玫瑰花结的水分饱和（turgid）重量（ TW R ））。
4. 根据它们的等级，从玫瑰花结中除去所有叶片，并用双面胶带将它们粘在A4纸上。该表格的模板包括用于进一步分析的校准方块和用于样品描述的方框（图5）。在剥离叶片的玫瑰花结之后测量叶柄的水饱和重量（ TW P ），并将叶柄粘在同一张纸上。
  
  图5.具有指定权重和最终叶片数的示例叶扫描
5. 计算花环（ LN ）和茎生叶（ L C N ），并记下这些数字。
6. 用纸扫描纸页并收集每个植物的叶片和叶柄以分离袋子。
7. 将袋子置于80℃3天，然后测量叶片（ DW L ）和叶柄（ DW <子> P 的）。
气孔密度测量
1. 从莲座上取下一片叶片（最大的叶子或特定的叶子等级）。用中间神经将它切成两半，用双面胶带将两半粘在一张纸上，两面朝上（图6A）。
2. 用薄薄的透明指甲油覆盖叶片。指甲油不要太粘稠，应避免形成气泡。
3. 干燥5分钟后，将单面胶带贴在指甲油层上，小心地将其从叶片上取下，并将其粘贴在标记的显微镜载玻片上。
  
  图6.表皮印记A.剥离指甲油后的叶片; B.表皮印记的示例显微照片。

数据分析

叶子扫描
使用自定义ImageJ宏分析叶子扫描（ http://bioweb.supagro.inra.fr /phenopsis/MacroImageJ.php ）。宏将提示您单击所有叶子，然后计算每个叶子的面积。每株植物的这些面积的总和是总叶面积（ TLA ）。
气孔特征
1. 将幻灯片放在立体显微镜下。从每个表皮印记中取出至少3张质量良好的代表性图像，图像区域可见50-200个气孔（ area ）（例如，图6B）。
2. 在每个图像计数气孔的数量（ num ）和路面单元的数量（ pav <子> NUM ）。可以使用在线提供的自定义ImageJ宏来执行气孔计数（ http：//bioweb.supagro。 inra.fr/phenopsis/MacroImageJ.php ）。所提供的链接还包含足够的文档，并清楚地说明如何执行细胞计数。
Rosette预测
1. 收集要在分析中使用的全景图像。为了成功进行曲线拟合，每4天需要一个图像。
2. 使用自定义ImageJ宏提取投影玫瑰花区（ PRA ）（ http： //bioweb.supagro.inra.fr/phenopsis/MacroImageJ.php ）。
计算特征
1. 计算性状值：玫瑰果干重（DW），叶片/叶柄比（DW）水分含量（WC），相对含水量（RWC ），叶干物质含量（）， > LDMC ）和每个区域的叶片质量（ LMA ）：
2. 计算气孔密度（S dens ）和气孔指数（ S I > ）：
3. 使用LOESS或曲线拟合（图7A）估计叶形成的动态（Vile等人，2012）：
  
  num 是测量时的叶号，
  a 是形成第一片真叶之后的天数，
  0 是 LN / 2叶开发的时间，
  LN 是最大叶数，
  b 是叶片生产的最大速率。
4. 用曲线拟合法预测玫瑰花结面积数据（图7B）估计生长速率参数（Bac-Molenaar等人，2015）。根据数据集的复杂程度，可以使用不同的函数，如简单的指数函数：
  
  是初始玫瑰花大小，
  r 是增长率;或更复杂的S形函数（Gompertz函数）：
  
  是最终花环大小，而 b 是沿着时间轴的位置。
  
  图7. A的动态增长测量。（蓝色），中度（红色）和严重（黑色）水分亏缺的拟南芥Col-0加入。A.莲座叶数的变化。数据来自物候阶段符号。线条和阴影分别对应于LOESS和标准误差。 B.预测莲座区面积的变化。线条对应于Gompertz曲线。
表1列出了所有可以使用该协议进行测量的特征。

表1.在基本的PHENOPSIS实验中测得的性状
1. 可以使用双向方差分析（ANOVA）来计算基因型（G），环境（E）和G×E相互作用的影响。多变量效应可以通过多变量ANOVA（MANOVA）进行分析。对于这些统计方法，需要额外的数据分析软件。
  在 A。拟南芥种质中，基因型效应趋于强烈，这使得直接观察植物反应变得困难。因此，除了绝对特质值的分析外，还应该计算和分析Rymaszewski等人（2017年）所做的对不同条件的响应比率。应答比率是处理条件下的平均特性值与对照条件下的平均特性值的对数化比率。
2. 处理多种基因型和多种性状时，使用主成分分析（PCA）等方法降低维度通常是有益的。这些方法也可用于在进行深入分析之前可视化并更好地理解数据结构。

食谱

注意：将去离子水加入到所需的体积。

营养液（150升）

H2PO4NH4
60 ml of 28.76 g/L stock

KNO3
120 ml of 88.45 g/L stock

Microelement solution
60 ml

Fe (E.D.D.H.A)
7.2 g

Adjust pH to 5.2-5.8 with HNO3
Microelement solution (5 L)

H3BO3
1.85 g

MnSO4∙H2O
1.90 g

CuSO4∙5H2O
0.03 g

ZnSO4∙7H2O
1.44 g

(NH4)6Mo7O24∙4H2O
0.06 g

致谢

由于欧盟FP7研究基础设施项目资助的欧洲植物现象分析网络（EPPN，赠款协议第284443号）的资金允许访问PHENOPSIS平台。这项研究还得到了来自波兰国家科学中心的PRELUDIUM（2012/05 / N / NZ9 / 01396）资助，授予WR PHENOPSIS开发项目得到了FEDER-FSE-IEJ 2014-2020朗格多克 - 鲁西荣APSEVIR和PHENOPSIS的支持2.0项目。作者声明不存在利益冲突。

参考

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Bac-Molenaar，J.A.，Vreugdenhil，D.，Granier，C。和Keurentjes，J.J。（2015）。生长动态的全基因组关联图谱检测时间特异性和一般数量性状基因座。 J Exp Bot 66（18）：5567-5580。
Baerenfaller，K.，Massonnet，C.，Walsh，S.，Baginsky，S.，Buhlmann，P.，Hennig，L.，Hirsch-Hoffmann，M.，Howell，KA，Kahlau，S.，Radziejwoski，A. ，Russenberger，D.，Rutishauser，D.，Small，I.，Stekhoven，D.，Sulpice，R.，Svozil，J.，Wuyts，N.，Stitt，M.，Hilson，P.，Granier，C.和Gruissem，W（2012）。对拟南芥叶生长的系统分析表明适应水分亏缺。 Mol Syst Biol 8：606.
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