材料和试剂

E。大肠杆菌分离UTI89（注1）（或其他ExPEC株）
Luria-Bertani肉汤（LB）培养基
RAW 264.7小鼠巨噬细胞样细胞（注2）
DMEM [高葡萄糖（HG），4,500mg/L]
胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich）
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）
庆大霉素（50mg/ml母液）
L-精氨酸
L-NAME（Cayman Chemical Company）
IFNγ，重组小鼠（EMD Millipore，目录号：IF005）
1％Triton-X 100（参见配方）
RAW 264.7培养基（DMEM + 10％FBS）（参见配方）
1 M L-精氨酸储备液（见配方）
1M L-NAME储备溶液（见配方）

设备

24孔组织培养皿
带微型板适配器的台式摇摆式离心机
37°C通气培养箱（用于液体细菌培养）
37℃具有5％CO 2的培养箱[用于巨噬细胞培养（注3）]
分光光度计
0.2微米过滤器

程序

第1天
1. 开始5ml过夜（16-18小时）的E培养。大肠杆菌在37℃，通气的LB中分离UTI89（或其他ExPEC菌株）。
2. 将种子RAW 264.7细胞以1×10 5个细胞/孔的密度接种到24孔盘（注释4）中，并允许在感染前粘附并生长至汇合36-42小时。对于一般维持，RAW 264.7鼠巨噬细胞常规地在DMEM（HG）+ 10％FBS中生长，并且使用细胞刮刀大约每3天亚培养1：4以分离粘附细胞用于亚培养。
第2天
1. 反向稀释细菌培养1：100到10ml新鲜LB培养基，并在37℃静态生长18-24 h诱导1型菌毛粘附因子的表达。这可以在锥形瓶或无菌培养皿中完成
2. 为了刺激NO表达和细胞因子的产生，在感染之前用1ng/mlIFNγ预处理几个孔的RAW 264.7细胞16-18小时（过夜）（参见下面的24孔板图）。 >
第3天
1. 1mM L-精氨酸包含在第二组RAW 264.7细胞的培养基中1小时，以在用E刺激时预加载细胞用于一氧化氮产生。大肠杆菌感染。 L-精氨酸是NO的前体
2. 第三组RAW 264.7细胞用1mM的iNOS特异性抑制剂L-NAME预处理1小时，然后感染以抑制NO产生。在实验期间，L-精氨酸和L-NAME随后包括在培养基中
3. 最后，第四组RAW 264.7细胞未处理（幼稚的）以用作未刺激的对照。
4. 用 E感染细胞。通过加入10μl的OD 600 = 0.8细菌悬浮液（〜1×10 7个集落形成单位（CFU）⁷ >或多重感染（MOI）为10）在PBS中用于所有4个治疗组的铺满的细胞单层（〜1×10 6个细胞/孔）。
5. 在具有微型板接头的摇摆式临床离心机中在低速下离心板以使细菌与细胞单层接触（在1,000rpm下5分钟），然后在37℃下用5％CO 2孵育1小时， sub>。
6. 通过以下步骤m至p）确定各种治疗组的初始1小时粘附/侵袭。该数量将用于在感染后24小时使CFU /孔正常化，以解释各种治疗组或细菌菌株之间初始粘附/侵袭的任何差异（注6）。
7. 对于剩余的治疗组，用0.5ml PBS洗涤感染的单层3次（避免用移液管吸头接触单层，或直接将洗涤施加到单层上，因为这可能干扰单层的完整性）。该步骤是除去多数的细胞外细菌）
8. 使用降低的庆大霉素方案（100μg/ml庆大霉素在DMEM HG + 10％FBS中培养2小时，然后用含有50μg/ml庆大霉素的培养基更换21小时）孵育24小时实验的剩余部分（注释 7）。
第4天
1. 用0.5ml PBS洗涤细胞3次。
2. 取出最后一次洗涤，加入1ml PBS + 0.1％Triton-X。吸管剧烈裂解细胞。少量起泡是可接受的。
3. 通过在LB中接种连续稀释液（包括取决于细菌菌株的合适的抗生素）并在37℃下孵育过夜来确定细胞内细菌负荷。
第5天
1. 计数板上的细菌性CFU
2. 各种治疗组和/或细菌菌株的感染后24小时的细胞内负荷应该归一化为相应的1小时粘附/侵袭计数。可以使用您最喜欢的图形化程序（Excel，GraphPad，等）绘制每个菌株和/或组的细菌负荷。不成对的双尾学生t检验可用于确定统计学显着性，其定义为达到p值≤0.05。

治疗组和对照组

笔记

UTI89是从膀胱炎的成年患者获得的原型ExPEC膀胱炎分离株，并且已经在文献中充分描述（Mulvey，1998）。也可以使用其他ExPEC分离物
RAW 264.7细胞购自ATCC。
注意，如果你不分离CO 2 sub注射孵化器微生物学和无菌组织培养工作，你将需要把细菌感染的巨噬细胞进入你的组织培养孵化器。如果你只有一个被认为是无菌的孵化器，你可以把你感染的巨噬细胞培养托盘放在没有盖子的塑料食品容器内。在顶部，放置一个展开的干燥的高压灭菌的纸巾，并使用橡胶带密封它包含的塑料食品。擦拭含有70％乙醇的塑料的外部，并将整个容器在组织培养孵化器。纸巾将允许文化的气体交换，同时防止气溶胶逃逸
所需的托盘数量将取决于几个因素。有4个治疗组：未治疗的，L-NAME（抑制NO），L-精氨酸（高NO）和IFNγ（巨噬细胞的活化导致高NO和细胞因子生产）。一组将用于确定初始1小时的粘附/侵袭，一组将用于24小时（或另一时间点）细胞内感染。治疗组和对照图仅作为起点。应包括额外的技术和生物学重复以确定实验变化
在开始感染之前，研究人员应通过连续稀释法测定PBS悬浮液中的细菌CFU。这将给您估计每孔添加的细菌悬浮液的量。还应在每次感染进行细菌接种的系列稀释以确定ach实验的确切MOI。同时，使用血细胞计数器在感染时计数汇合单层细胞以给出准确的MOI。
这是确定不同处理后或在不同菌株中的细胞内存活的重要步骤。如果初始粘附/侵袭率不同，则在感染后24小时的后续细胞内存活率将偏斜。对于初始1小时的粘附/侵入，进行步骤（m）。继续通过所有步骤24小时感染。
在感染开始后，IFNγ不包括在培养基中;然而，在实验期间，L-精氨酸和L-NAME包括在培养基中

食谱

RAW 264.7培养基（DMEM + 10％FBS）
450ml DMEM（HG）
50ml FBS
通过0.2微米过滤器过滤灭菌。根据测试和复制的细菌菌株数量，根据需要进行制备。
1μML-精氨酸储备液
0.871g L-精氨酸 5ml dI H 2 O·
重悬和过滤灭菌通过0.2微米过滤单元。在1 mM或1,000倍稀释的工作浓度下使用。
1 M L-NAME储备液
1.35 g L-NAME
5ml二H 2 O 2 / 重悬和过滤灭菌通过0.2微米过滤单元。在1 mM或1,000倍稀释的工作浓度下使用。
1％Triton-X 100
1ml Triton-X 100
99ml diH 2 O x/v 混合好。使用1毫升/孔重悬，并用细胞内的E裂解RAW 264.7细胞。大肠杆菌感染

致谢

该协议改编自Bateman和Seed（2012），并已成功应用。

参考文献

Bateman，S.L.和Seed，P.C。（2012）。亚硝化应激反应和细胞内巨噬细胞存活的表观遗传调节肠外致病性大肠杆菌。 Mol Microbiol 83（5）：908-925。
Bokil，N.J.，Totsika，M.，Carey，A.J.，Stacey，K.J.，Hancock，V.，Saunders，B.M.，Ravasi，T.，Ulett，G.C.，Schembri，M.A.and Sweet，M.J。（2011）。 uropathogenic大肠杆菌的巨噬细胞存活：：不同临床分离物之间的差异小鼠和人巨噬细胞。 Immunobiology 216（11）：1164-1171。
Mulvey，M.A.，Lopez-Boado，Y.S.，Wilson，C.L.，Roth，R.，Parks，W.C.，Heuser，J.and Hultgren，S.J。（1998）。通过1型piliated uropathogenic大肠杆菌诱导和逃避宿主防御。 Science 282（5393）：1494-1497。