材料和试剂

1.5ml Eppendorf管（例如，Sigma-Aldrich，目录号：Z336769）。
0.2ml薄壁PCR管（例如，Corning，目录号：6571）
2厘米厚的胶带（Tesa）
玻璃载玻片（例如，VWR，目录号：631-0411）和盖玻片（ eg ，22×22×0.17mm，Marienfeld-Superior，目录号：0107052）样品制备
15ml试管（例如，Corning，Falcon ，产品目录号：352097）
0.22微米的过滤器（例如，Corning，目录号：431227）
3厘米宽的折叠式回形针（，Staples，产品目录号：WW-9130156）
胺反应性标签（测试和工作）：
1. BDP-FL-NHS（Lumiprobe，目录号：11420）
2. Atto-tec Atto488-NHS（Atto-tec，目录号：AD488-31），Atto532-NHS（Atto-tec，目录号：AD532-31），Atto565-NHS（Atto-tec，目录号：AD565 -31）和Atto633-NHS（Atto-tec，目录号：AD 633-31）
3. AlexaFluor488-NHS（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：A20000）
4. Abberior STAR 470SXP-NHS（Abberior，目录号：1-0101-008-3）和Abberior STAR RED-NHS（Abberior，目录号：1-0101-011-3）
5. 生物素-NHS（Sigma-Aldrich，目录号：H1759）
无水DMSO（例如，Sigma-Aldrich，目录号：276855）
可选：硅胶（如，Merck，产品目录号：1.01969.1000）（见注1）
氨基-11-ddUTP（Lumiprobe，目录号：15040）或5-炔丙基氨基-ddUTP（Jena Biosciences，目录号：NU-1619）
1M NaHCO 3 3，pH 8.4（例如，Sigma-Aldrich，目录号：S5761）。
定制设计的非特异性ssDNA寡核苷酸目标特定阵列（脱盐纯化就足够了，参见设计软件部分）
20U /μl含有5xTdT缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：EP0161）的末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）
1-3M乙酸钠，pH5.5（例如，Sigma-Aldrich，目录号：S2889）。
5mg / ml直链丙烯酰胺（例如，Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM9520）。
乙醇（例如，Merck，EMD Millipore，目录号：1.00983）
1. 100％乙醇，-20°C
2. 80％乙醇，4℃
3. 70％乙醇，RT
不含核酸酶的ddH 2 O（例如，New England Biolabs，目录号：B1500S）
40％丙烯酰胺/双溶液，29：1（例如Bio-Rad Laboratories，目录号：1610146）。
尿素（例如，，Sigma-Aldrich，目录号：U5378）
N，N，N'，N' - 四甲基乙二胺（TEMED）（例如，Sigma-Aldrich，目录号：T9281）。
10％（w / v）过硫酸铵（APS）（例如，Sigma-Aldrich，目录号：A3678）。
6x凝胶加样染料（例如，新英格兰生物实验室，目录号：B7021S）。
SYBR-GOLD（例如，Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：S11494）。
可选：比色生物素测定试剂盒（比如，Sigma-Aldrich，目录号：MAK171）（见注8）
20mg / ml蛋白酶-K（例如，Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM2546）。
安装介质
1. VectaShield（Vector Laboratories，目录号：H-1000）
2. 80％TDE（见食谱）
Pierce Amidin琼脂糖（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：20219）
Dynabeads MyOne TM C1（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：65001）
Quick-RNA TM MicroPrep试剂盒（Zymo Research，目录号：R1050）
Tris-HCl pH 7.0（例如，Sigma-Aldrich，Roche Diagnostics，目录号：10812846001）。
比色生物素测定试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：MAK171）
Tris碱（例如，Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
乙二胺四乙酸（EDTA）（例如，Sigma-Aldrich，目录号：E5391）
氯化钠（NaCl）（如emck，Merck，目录号：106404）
氯化钾（KCl）（如emck，Merck，目录号：104936）
磷酸二氢钾二水合物（KH2PO4•2H2O）（例如Merck，产品目录号：
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（例如Merck，产品目录号：106342）
EM级多聚甲醛（例如，Electron Microscopy Sciences，目录号：15710）
Triton X-100（例如，Sigma-Aldrich，目录号：X100）
硼酸（如emck，Merck，目录号：100165）
碳酸亚乙酯（例如，Sigma-Aldrich，目录号：E26258）
50mg / ml肝素（例如，Sigma-Aldrich，目录号：H3393）。
10mg / ml鲑鱼精子DNA（例如，Sigma-Aldrich，目录号：D7656）。
2,2'-硫代二乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：166782）
20％（v / v）SDS（例如，Sigma-Aldrich，目录号：05030）。
PMSF（如，Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
cOmplete mini mini EDTA无蛋白酶抑制剂（Roche Diagnostics，产品目录号：11836170001）
RiboLock RNA酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：EO0381）
柠檬酸钠（例如，Sigma-Aldrich，目录号：S1804）
TE缓冲液（见食谱）
1x PBS（见食谱）
固定剂（见食谱）
PBT（见食谱）
1.5倍的PAGE加载缓冲区（见食谱）
1x和10x TBE（见食谱）
15％PA - 8 M尿素（见食谱）
20x SSC缓冲液（见食谱）
2次全HYBEC（见食谱）
2次洗涤 - HYBEC（见食谱）
裂解缓冲液（见食谱）
捕获杂交缓冲液（见食谱）
低盐洗涤缓冲液（见食谱）
高盐洗涤缓冲液（见食谱）
洗脱缓冲液（见食谱）

设备

可选：惰性气体（例如，Argon）手套箱（例如，惰性技术，型号：PureLab HE 2GB）（见注1）
带有可编程热盖的PCR仪（如，Bio-Rad Laboratories，目录号：1851148）
-20°C冷冻机
冷藏台式离心机（例如，Eppendorf，目录号：5426000018）
锥形瓶
Handcast PAGE系统，包括1mm间隔板（例如，Bio-Rad Laboratories，产品目录号：1653311），短板（例如Bio-Rad Laboratories，目录号：1653308）和15孔梳（例如Bio-Rad Laboratories，目录号4560016）。
垂直电泳细胞（例如，Bio-Rad Laboratories，目录号：1658005）
电泳电源（例如，Bio-Rad Laboratories，目录号：1645050）
凝胶文件系统，带有过滤器，用于对SYBR-GOLD的荧光和用于标记的荧光染料（例如，Bio-Rad Laboratories，目录号：17001402）进行成像。
P2，P200和P1000移液器
摇摆式热电偶（，Eppendorf，型号：ThermoMixer®C，产品目录号：5382000015）
用于成像的显微镜（我们使用装配有63x NA = 1.4油浸物镜和两个HyD检测器的Leica SP8（Leica，型号：Leica TCS SP8））
组织研磨机（例如，DWK生命科学公司，Kimble，产品目录号：8853000015或8853000040）
旋转器（，例如，Cole-Parmer，Stuart，型号：Rotator SB3）
磁力架（例如，新英格兰生物实验室，目录号：S1507S）
无潮湿室（见注1）
UV / VIS分光光度计（例如，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：NanoDrop TM 8000，目录号：ND-8000-GL ）
Nutator（，例如，Labnet International，型号：S0500）

软件

探针设计器算法，例如，Stellaris TM探针设计器
（ https://www.biosearchtech.com/support/tools/设计软件/ stellaris-probe-designer ，需要注册）或提供的 smFISHprobe_finder.R 脚本（补充文件1 ，请参阅注释2和17）
MS Office Excel运行交互式 probe_calculator.xls 工作表（补充文件2 ）
ImageJ / FIJI（ https://imagej.nih.gov/ij/ ）与xsPT插件（ https://github.com/Xaft/xs/blob/master/_xs.jar ）
可选：解卷积软件，例如，Huygens Essentials（ https://svi.nl/Huygens- Essential ）或DeconvolutionLab2（Sage et al。，2017; http ：//bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/ ）
R（优先与RStudio）进行数据分析
smFISH_analysis.R 来分析smFISH的敏感性和特异性（补充文件3 ）

程序

图1.三锅式探针生产测定的图形概述。：一种。标签与NH2-ddUTP终止子核苷酸偶联; B.TdT介导的ssDNA寡核苷酸的标记; C.纯化标记的ssDNA分子（探针）。

制备染料结合的ddUTP（第一个罐，图1A）
1. 在无水环境中将染料-NHS酯在无水DMSO中重建至40mM最终浓度。（见注1）
2. 在干净的1.5ml Eppendorf管中，等分Xμl20mM氨基-11-ddUTP或5-炔丙基氨基-ddUTP。（见注3）
3. 加入0.2Xμl的1M NaHCO 3（pH = 8.4）。
4. 最后，加入40μl染料-NHS酯（见注4）。充分混合并在室温孵育2小时，避光。
5. 孵育后，加入1.8XμldH 2 O 0将反应体积扩大至4Xμl。这导致5mM库存的染料结合ddUTP（参见注释5）。
  所产生的标记核苷酸在-20°C储存一年内稳定。
生产标记的ssDNA寡核苷酸（第二个罐，图1B）
1. 准备应标记在一起的所有不同ssDNA寡核苷酸的等摩尔混合物，即靶向相同转录物的。寡核苷酸的总浓度不应低于100μM。（见注6）
2. 要标记1 nmol的寡核苷酸混合物，请在0.2 ml薄壁PCR管中制备以下标记混合物：
  请使用交互式的 probe_calculator.xls Excel工作表（补充文件2 ），将反应组合物调整为用于标记的染料-ddUTP。
3. 在热盖设置为37°C的PCR仪中，在37°C O / N（16-18 h）下孵育。
标记的寡核苷酸混合物的纯化和光谱分析（第三个罐，图1C）
1. O / N孵育后，向反应混合物中加入60μl1M醋酸钠（pH = 5.5），125μldH 2 O和1.5μg直链丙烯酰胺。
2. 将整个200μl转移到干净的1.5ml Eppendorf管中。加入800μL预冷的-20°C的100％乙醇。
  翻转管几次，并将其放入-20°C冰箱约15-20分钟。
3. 同时，将台式离心机冷却至4°C。
4. 在-20℃温育后，在4℃下将寡核苷酸混合物在16,000×gg下旋转20分钟。
5. 取出上清液并加入1ml预冷的4％的80％乙醇。漩涡直到颗粒从管底部分离。
6. 在4℃下以16,000×g g离心5分钟。
7. 用1 ml 80％乙醇将试管中的沉淀洗去，并将包括浮动沉淀在内的整个体积转移到干净的1.5 ml Eppendorf试管中。重复步骤C5和C6两次。
8. 从最后一次清洗中取出上清液，让沉淀物在空气中干燥。（见注7）
9. 在15-50μl不含核酸酶的dH sub 2 O中重悬干燥的颗粒。
10. 测量标记的寡核苷酸混合物在260nm和最大染料吸收（例如，对于Atto565，570nm）的吸光度。
11. 为了计算浓度和标记程度（DOL），在260nm下测量未标记的，未稀释的寡核苷酸混合物的吸光度。（见注8）
12. 通过将测得的OD 260nm值与混合物浓度（以M计）相除来计算寡核苷酸混合物的摩尔消光系数（εoligo）。将此值增加9,000 mol -1 -1 sup -1以校正加入到ssDNA分子3'中的UTP。
13. 通过将染料校正的OD 260nm吸收除以ε寡核苷酸来计算标记的寡核苷酸的浓度：c =寡核苷酸=（OD n）（参见注释9）。
  260nm-cf 260nm×OD染料）/ε寡核苷酸（见注9）。
14. 计算染料的浓度如下：染料= OD染料/染料染料（由染料生产商提供）。
15. 通常，只有一小部分染料分子作为污染物存在（即，不含ssDNA），因此DOL估计如下：DOL = c染料/ c oligo 。
16. 回收的寡核苷酸的比例通过将回收的寡核苷酸与初始量的比例（回收率=初始寡核苷酸×重新悬浮液/初始重量％ / sub>）。
17. 测量的OD值可以输入到交互式的 probe_calculator.xls Excel工作表中（ Supplementary File 2 ）以获得标记的寡核苷酸混合物的浓度和DOL。
18. 将标记的探针储存在-20°C。
3P <3>探针生产的故障排除
标记的具有0.9 < DOL≤1.0被认为是可用于smFISH应用的优质产品。
1. DOL低于0.9的最典型原因是寡核苷酸混合物的组成。我们目前还不了解混合物的哪些性质（例如，混合物中分子内和分子间杂化体的形成）会影响标记效率。但是，如果DOL＆lt; 0.9时，我们推荐将寡核苷酸混合物“分裂”成2-3个非重叠部分，即制备原始混合物中存在的ssDNA寡核苷酸的2-3个混合物。这些混合物的单独标记可以帮助识别在标记反应中表现异常的任何分子。在大多数情况下，我们发现这种“分裂”几乎完全缓解了低标记效率问题，即每种分裂混合物的DOL增加到0.9以上。
2. 我们发现的另一个解决方案是重新标记已经标记的寡核苷酸混合物，即开始通过使用标记的ssDNA分子作为输入的来自步骤B2的标记方案。（REF）
3. 低DOL的第二个最常见原因是未标记的寡聚体混合物的摩尔消光系数的测量结果不准确（低于实际值）。这可以注意到，当计算回收的寡核苷酸的比例（回收率％）时，获得高于1的值。在这种情况下，我们建议重新测量不同浓度（ eg ，50,100和200μM）的未标记寡核苷酸混合物的OD 260nm，并估计ε通过取适合数据点的线的斜率来确定 oligo 。
4. 我们发现TdT的末端转移酶活性因批次而异。当使用1倍标准量的酶时，这可能导致不适当的标记（DOL <0.9）。我们建议在开始一个新的TdT等分试样时重新定义标准量，方法是使用递增浓度的TdT 例如设置单个ssDNA寡核苷酸与Atto633-ddUTP（程序B和C），配方生成器中标准量的1倍，2倍和3倍。使用产生DOL>的酶的最小浓度> 0.9作为新的标准金额。
5. DOL＆gt; 1.0也可能指示不精确确定的ε寡核苷酸。这将表现为寡核苷酸的巨大损失（恢复<50％）。尝试与步骤D3中相同的解决方案。
6. 如果ε oligo 是合适的，则DOL> 1.0表示自由染料污染。在这种情况下，建议通过PAGE测量DOL（程序E）。如果通过密度测定法测定的DOL是〜1.0并且两种DOL的差异很小（最大0.05-0.1），则在下游应用中游离染料污染被认为是无害的。如果它更高，推荐通过另一种方法（例如，通过尺寸排阻色谱法）重新纯化寡核苷酸混合物。当使用Abberior470SX-，Atto488-和AlexaFluor488-ddUTP时（Gaspar等人，2017b），我们观察到如此高的游离染料污染。
标记的寡核苷酸的PAGE分析
凝胶电泳提供了一种简单的方法来确认从光谱数据估计的DOL，并在非荧光修饰（例如，生物素化）的情况下计算DOL。 PAGE分析还允许对大多数标记的ddUTP类似物质量进行质量控制，以确定染料结合的ddUTP原液中是否存在未偶联的ddUTP分子（在程序A中产生），这会导致DOL降低的寡核苷酸。
重要：只应通过PAGE分析含有相同长度（例如仅20个）的ssDNA分子的寡聚物混合物。
1. 用70％乙醇擦拭凝胶铸件清洁玻璃板，组装盒子并密封20毫米宽的透明胶带，打开顶部（梳子将插入的位置）。将两个折叠式夹子放在盒子的两侧，使夹子夹在两块玻璃板之间的间隔物上方。
2. 要浇铸10×8厘米的丙烯酰胺凝胶，添加8毫升15％PA - 8 M尿素储备（请参阅食谱），40微升10％APS和5微升TEMED到一个锥形瓶中。充分摇匀烧瓶并将混合物倒入组装好的盒子的两块板之间。填充到顶部。
3. 插入梳子，水平放置盒子，等待凝胶聚合（15-20分钟）。
4. 卸下夹子，胶带和梳子。用dH2O冲洗盒的外部以去除在外表面上聚合的凝胶片并组装PAGE室。
5. 填充1x TBE缓冲液（见配方），用2.5 mA / cm电流（20 mA，8 cm长的凝胶）预凝胶30分钟。
6. 同时，通过混合3μl1.5x PAGE上样缓冲液（参见食谱）和2μl含15-60 pmoles标记寡核苷酸的寡核苷酸混合物来制备5μl的每种样品。由于大小标记使用未标记的寡核苷酸混合物的稀释行（例如1.5cm 3和6pmol），所以不需要沸腾。
7. 预运行（E5）后，使用P200移液器用1x TBE冲洗凝胶上的所有孔，以除去积聚的尿素，以防止加载。
8. 装入样品并运行凝胶，直到二甲苯蓝（蓝色）和溴酚蓝（紫色）标记（来自6x凝胶上样染料）达到凝胶长度的三分之一和三分之二。
9. 用凝胶成像仪对荧光标记的分子池进行成像，使用适当的滤光片组激发并检测掺入的荧光染料。
10. 在1x TBE中用1：10,000稀释的SYBR-GOLD（或类似的RNA / ssDNA染料）孵育凝胶10-15分钟。
11. 重新凝胶图像以检测未修饰和修饰的ssDNA库。
12. 由于添加了大体积的终止子核苷酸，标记的寡核苷酸运行较慢，因此它们在PAGE期间与其未修饰的同位体充分分离。未修饰寡核苷酸的量可以通过比较相应的SYBR-GOLD荧光强度与用作上样对照的未标记寡核苷酸混合物稀释行的强度来测量（图2A和2A'）。
13. 未缀合的ddUTP的存在将导致产生未标记的，ddUTP终止的寡核苷酸。在凝胶上，它们表现为在未标记和标记的寡核苷酸荧光池之间迁移的中间条带。
  
  图2.标记的寡核苷酸混合物的PAGE分析。使用Atto633-氨基-11-ddUTP（泳道4）或Atto633-5-炔丙基氨基-ddUTP（泳道5）标记osk20nt-15x（Gaspar等人，2017b）探针混合物）。与未标记的寡核苷酸（绿色，A，灰色，A'）相比，荧光标记的ssDNA物种（洋红色，A）在凝胶中迁移较慢。请注意，标有远红色荧光的探针分子在SYBR-GOLD通道中不可见，可能是因为从SYBR GOLD到Atto633的非常有效的能量转移形式可以淬灭SYBR GOLD荧光。当其他远红染料（例如，Abberior-RED）也是如此，当没有淬灭染料存在时（例如，生物素化探针）或当FRET荧光可以通过SYBR GOLD成像设置（例如，在Atto565的情况下）检测到，标记的探针出现在SYBR GOLD通道中（Gaspar et。，2017b ）。将1.5,3,6,20和20pmol ssDNA混合物分别加载到1-5泳道。在与任一终止子核苷酸进行标记反应后，仅有少量（≤1.5pmol）未标记的寡核苷酸留在混合物中（泳道4和5A和5A'），表明用两种终止子核苷酸进行近定量标记。红色箭头表示溴酚蓝染料的荧光。
果蝇卵巢中的单分子FISH
1. 将卵巢解剖成含有300-500μl固定剂的1.5ml Eppendorf管（卵巢解剖，请参阅Gaspar和Ephrussi，2017）。
2. 通过章动解剖的材料修复20分钟
3. 取出固定剂，用1毫升PBT冲洗卵巢（见食谱）。
4. 在1毫升新鲜PBT中清洗卵巢10分钟
5. 取代PBT并将蛋白酶-K加至2μg/ ml终浓度。在室温（RT）下固定5分钟。（见注10）
6. 在PBS中预热0.5 ml 0.05 v / v％SDS（见配方）至95°C
7. 5分钟蛋白酶-K消化后，取出PBT并立即将预热的SDS / PBS施用于卵巢。在95°C孵育5分钟。
8. 加入1 ml RT PBS至卵巢以冷却溶液。
9. 用200μl2x全HYBEC取代洗液（见食谱）。
10. 将试管转移至37-42℃的摇摆热块，并以1000RPM摇动10分钟。
11. 同时，在50μl2x全HYBEC中制备探针溶液（5-12.5 nM /单个探针）。将探针溶液转移到加热块并让其预热（2-3分钟）。（见注11）
12. 在卵巢孵育10分钟后，通过将探针溶液混合到样品上已经存在的200μl2x全-HYBEC中来施用探针溶液。
13. 在37-42°C孵育1.5-3小时，同时以1,000 RPM摇摆。
14. 孵育结束前10-15分钟，预热两次1ml 2次洗涤-HYBEC（参见食谱）至杂交温度。
15. 去除杂交溶液 - 它可以保持在4°C进行另一次杂交 - 并用1毫升预热的2x洗涤液 - HYBEC洗2×15分钟。
16. 用1 ml RT PBT再洗涤一次15分钟。
17. 彻底清除PBT并使用安装介质，例如，80％TDE（见食谱）或VectaShield。（见注12）
18. 在允许安装介质浸泡至少1小时后，将卵巢安装到载玻片上并使用高NA（> 1.1NA）目标（图3A）对其进行成像。
  
  图3.在发育中的果蝇卵室中oskar mRNA的smFISH分析A. oskar mRNA在转录活性护士细胞中产生（左）并将其运送到卵母细胞中，最终在后极处定位（在右侧）。女性生殖系细胞（护士细胞+卵母细胞）被一层体细胞上皮细胞包裹，卵泡细胞不表达oskar mRNA。 B.通过两种不同探针组osk37x-Atto532（绿色，osk3UTR＃1-15 + oskCD＃1-22）和oskCD20x-633检测到在A. oskar mRNA中的盒装区域的特写（红色，oskCD＃23-42，加斯帕尔等人，2017b）。在护士细胞区室（B）中两个点样信号存在高度的共定位，并且在毛囊细胞（B-B“）中没有检测到这种强烈的探针积聚。箭头表示护士细胞的多倍体细胞核内的多个转录基因座（B）。比例尺表示10微米。 C和D.两个通道的信号强度的相关性。 C.当考虑蛋室中的所有物体时，建立强烈的线性相关性（R 2 = 0.972），表明检测到的物体的RNA含量是可变的。通过将多个高斯函数拟合到信号强度分布上（Little等人，2015; Gaspar等人，2017b），可以过滤含有单个拷贝的 oskar RNA。 D.在这种情况下，信号强度的相关性是低到中（R 2 = 0.264），然而绝大多数的目标可以在两个通道中被检测到 - 例如，在Atto633通道中分析的对象中，88.6％也可以在Atto532通道中检测到。垂直和水平黑色虚线分别代表Atto633和Atto532通道的检测阈值。红色虚线显示RNA（C）的单个和多个拷贝的物体之间的边界。颜色表示两个通道之间的相对强度差异（参见面板C中的键）。
  
  smFISH对象的数量（实验数量）用C和D表示
来自卵巢裂解物的RNA捕获
1. 从PBS喂养2-3天龄的果蝇中分离卵巢（见注13）。
2. 取出PBS并用3倍体积的裂解缓冲液重悬。
3. 使用组织研磨机械均化。
4. 转移到新鲜的15ml试管中并通过离心（140微克×克5分钟）清除裂解物。
5. 将上清转移至新鲜试管中，用2倍体积的杂交缓冲液稀释（参见食谱）。
6. 通过加入1:50 v / v Pierce 抗生物素蛋白琼脂糖进行预清洗，预先用1：2裂解缓冲液混合并捕获杂交缓冲液。
7. 在室温下保持旋转器30分钟。
8. 通过离心除去抗生物素蛋白琼脂糖（140微克×克5分钟）。
9. 将预先裂解的裂解物（保留0.1％作为输入样品）分开，并用每毫升卵巢靶向和非靶向对照生物素化DNA探针0.25μg（参见注释14）补充并在旋转器上在37℃孵育2小时。
10. 预洗3.75μl磁性链霉抗生物素蛋白珠粒/ ml溶胞产物，混合裂解缓冲液和捕获杂交缓冲液1：2。
11. 将磁性链霉抗生物素蛋白珠子加入到裂解物中并在37℃下保持旋转1小时。
12. 使用磁力架收集珠子
13. 在37°C用低盐洗涤缓冲液洗珠三次，每次5分钟（见食谱）。
14. 在37°C用高盐洗涤缓冲液洗两次珠子5分钟（见食谱）。
15. 在37°C用低盐洗涤缓冲液洗三次珠子5分钟
16. 通过加入洗脱缓冲液（参见食谱）从珠子中洗脱RNA，并在95℃煮沸5分钟。使用约。
  在步骤H10中使用0.75μlTE缓冲液/μl链霉亲和素珠浆液。
17. 使用RNA提取试剂盒提取RNA，并通过qRT-PCR或Northern印迹确定捕获的靶向和非靶向探针的RNA量。

数据分析

确定smFISH的特异性和敏感性
1. 使用一系列单标记探针检测靶转录物的原理是，由于整个阵列的特异性杂交，特定RNA分子上的信号相对于由例如产生的背景的局部增加，个体探针分子的随机非特异性结合（Femino等人，1998; Raj等人，2008）。因此，大多数非特定性显示为可以被滤除的背景（，例如，由本节的第7步中的xsPT插件）。然而，在极端情况下，探针可能积聚在特定的亚细胞结构/细胞器中，主要存在于核仁中。如果观察到这种情况，我们建议通过提高温度和/或降低相应缓冲液中的盐浓度来提高杂交的严谨性和随后的两个洗涤步骤（程序F的步骤10-15）。也可按此顺序尝试降低探针浓度并增加有机溶剂的相对量（例如，碳酸亚乙酯）（参见注释16和18）。
2. 为了测试给定的smFISH装置（包括探针组和应用的方案）是否检测到所有的靶分子和仅靶分子，可以进行针对感兴趣的转录物的双色smFISH反应（图3B-3B“和视频1）。
  
  视频1
3. 将未标记的ssDNA寡核苷酸分成两个不重叠的阵列，并按照程序B和C中所述将两个光谱可区分的荧光团标记为例如Atto532和Atto633（参见注释6）。
4. 按照程序F所述进行smFISH实验 - 例如，同时使用两套探针。
5. 通过在共聚焦扫描显微镜过程中执行顺序扫描，获取两种荧光团的图像，同时避免两个通道的串扰 - 例如。
6. 可选：对结果图像执行解卷积以提高信噪比并促进下游分析。
7. 通过使用ImageJ的xsPT插件（Gaspar和Ephrussi，2017），分析两个信号的重叠（例如）。
8. xsPT将其中一个通道分段（有关更多详细信息，请参阅Gaspar和Ephrussi，2017），并通过图像序列执行跟踪，例如，一个允许识别3D对象的Z-stack。
9. 设置插件的参数以检测参考通道中的全部或至少大部分物体（详情请参阅2017年Gaspar和Ephrussi的视频S4和S5）。在跟踪部分中，设置1px的最大位移（物体的中心在切片之间预计不会有太大偏移），设置'选择短步骤'并取消选中'手动跟踪'（ ie ，执行自动跟踪）。让插件运行。
10. 当图像根据改进的奈奎斯特准则进行四倍过采样时，RNP-以及小于衍射极限的其他结构 - 预计将在至少三个连续切片中被观察到（z步长通常在180-300nm之间）。删除短于三帧的轨迹（'最小轨迹= 3'并按'过滤器轨迹'）。您可以通过在图像中选择一个感兴趣的区域并按'过滤器轨迹'来进一步过滤识别的对象。
11. 保存已过滤的轨迹。参考和任何其他通道的积分信号强度将存储在生成的.csv文件中。这样的.csv文件的四（补充文件4-7 ）作为示例提供。可以使用 smFISH_analysis.R 脚本分析这些（以及任何用户生成的文件）（补充文件3 ）。
12. 确定参考通道的检测阈值（，例如，积分信号强度的最小或最低百分位数）。
13. 使用另一个通道作为参考重复步骤A9-A12。该分析结果可以独立测量两个通道的检测阈值。
14. 测试非参考通道的哪些部分物体具有比在并行分析中确定的相应检测阈值更高的信号强度。如果这两个通道的分数超过80％，smFISH分析被认为是单分子灵敏度（低假阴性检测）和高特异性（低假阳性检测率）（图3D）。
15. 低于80％的两个探针组共同检测相同的转录物 - 在极端情况下，两个信号没有重叠或完全没有信号 - 表明灵敏度不足，这通常是由于杂交过程中过高的严格度以及随后的两个洗涤（程序F的步骤10-15）。为了克服这个问题，我们建议降低温度，增加相应缓冲液中的盐浓度以及探针浓度，并减少杂交过程中有机溶剂的相对量（尝试按照所列顺序依次实施这些变化）（见注16和18）。
16. 绘制参考信号和非参考信道的信号强度可以深入了解对象的RNA拷贝数（图3C）。在单个RNA分子的情况下，这两种信号预计不会很好地相关，因为它们主要由随机事件（例如，探针的杂交效率，图3D）控制。如果对象中有多个目标转录本，那么这些随机事件倾向于平均，两个通道信号之间的线性关系会随着信号强度的增加而变得越来越强。
确定RNA捕获的效率和特异性
1. RNA提取后，设置0.1％输入样品的逆转录，并从非靶向和特异性捕获中洗脱样品（参见注释15）。
2. 从cDNA中，对'输入'（例如，0.1％，0.01％，0.001％和0.0001％）进行稀释系列并将'捕获'样品稀释至少10倍。设置qRT-PCR反应的一式三份以从“输入”稀释液和洗脱的“捕获”样品中扩增靶转录物和其他丰富的非靶RNA（例如，18S核糖体RNA）合适的PCR引物对。
3. 通过将其与稀释的“输入”样品的回归进行比较来计算“捕获的”RNA的量。有关更多详情，请参阅Gaspar 等，2017b。

笔记

您可以使用充满氩气的腔室。另一种获得无水环境的简单方法是将50-100克硅胶填充到约20×20×20厘米的带有盖子的聚苯乙烯或塑料盒中。
smFISHprobe_finder.R 脚本设计靶向特异性反义ssDNA寡核苷酸，使得在标记期间添加的末端尿嘧啶核苷酸将成为杂交体的一部分。对这些探针之间的任何大的间隙（＆lt; minLength 的两倍）进一步扫描不满足该终端U规则但满足其他搜索标准的潜在探针。或者，可以使用探针查找程序脚本，而不使用终端U规则（ smFISHprobe_finder.R 脚本的第93-96行）。值得注意的是，我们发现在产生的探针的3'末端杂交期间没有互补的尿嘧啶核苷酸的对抗效应（数据未显示）。
我们发现氨基-11-ddUTP或5-炔丙基氨基-ddUTP在染料结合和酶促掺入所得终止子核苷酸方面没有实际差异（图2）。
我们发现BDP-FL-NHS酯非常疏水，需要更高的有机溶剂浓度。当使用这种染料时，在步骤A4的染料中缓慢滴定之前加入1.8倍DMSO，并跳过步骤A5。如果发生降水，请添加更多的DMSO并相应计算最终浓度。
最初，我们加入Tris-HCl，pH 7.5至终浓度为10 mM以终止剩余的NHS酯活性。然而，我们发现省略这个淬火步骤对下游酶促反应没有不利影响。
尽管所有靶向相同转录产物的寡核苷酸都可以在一种主混合物中组合，但我们建议通过将其他寡核苷酸组合成至少两种非重叠混合物（例如），将它们分成5'和3将它们按寡核苷酸长度分成两半或两组。分开标记这些混合物 - 当观察到低程度的标记（程序E）并且还允许基准smFISH性能（程序G）时，这将便于故障排除，即。我们通常将重新悬浮于H 2 O中的寡核苷酸订购至250μM浓度。
为了促进干燥，在去除大部分上清液后，确保通过快速离心脉冲将所有残留的乙醇从管壁除去。
为了确定生物素化程度，可以使用基于2-（4-羟基苯偶氮） - 苯甲酸的颜色损失的比色生物素测定试剂盒。然而，我们发现生物素-ddUTP的掺入总是100％（参见Gaspar等人的图1，2017b），因此我们不常规地确定生物素化程度。
有机染料通常在260nm处也有一些吸收。由染料制造商提供的在260nm（cf260nm）的校正因子将该吸光度指定为染料的最大吸收的分数。当计算寡核苷酸浓度时，该最大值260nm和染料的吸收允许校正OD 260nm值。
程序F（smFISH）的步骤5-8将导致蛋白质和RNA二级结构的有限蛋白水解和变性，并且因此它们可以促进探针的目标识别。然而，如果要保存荧光蛋白（例如，Emerald-GFP，如Gaspar等人，2017a）的荧光，则应省略这些步骤。在 oskar mRNA的情况下，我们发现省略这些步骤对杂交结果的影响很小。
我们使用的最终探针浓度在1-2.5 nM /探针之间。我们发现较低的浓度可能会损害反应的敏感性，而较高的浓度（尽管很少会导致染色伪像）不会影响杂交的质量，但会导致不必要的材料浪费。
我们发现80％的TDE增加了GFP和红色荧光蛋白的亮度，而不影响Atto565和Atto633的信号。然而，绿色和黄色荧光染料在该安装介质中基本上较暗，因此我们推荐使用，例如，VectaShield。
如果由于靶RNA的丰度很低而需要大量的起始材料，我们使用一种大规模分离卵巢的方法（类似于2015年的Jambor等人，）。
探针浓度应根据样本中存在的RNA量进行调整。我们通过qRT-PCR或Northern印迹以及已知的靶RNA标准来估计所需靶RNA的量。
确保不要使RT反应过饱和。最大体积由“输入”样本的浓度决定。
我们建议一次只更改一个参数。在这些优化步骤中包含原始值和参数的两三个修改值是一种很好的做法。我们发现，一旦列出的参数针对样本进行了优化，对于使用尚未表征的探针组进行的所有smFISH反应，它们都是一个很好的起点，并且在95％的情况下，这些参数提供了优质的结果。
然而，由大部分探针阵列与另一个转录物的（部分）互补性引起的“特异性”可能导致信号与特定杂交体产生的信号不可区分。这种现象只能在缺乏待检测RNA（RNA无效突变体或高效RNAi敲除）的对照样品中检测。由于这些对照样本在大多数情况下不易获得，因此我们建议在设计阶段（启动程序B之前）对探针序列进行针对宿主转录组的BLAST探针序列，以排除此类隐蔽目标。
如果一个已经测试过且经过验证的工作探针组导致这种低灵敏度杂交，原因可能是其中一个缓冲液中的核酸酶污染。在这种情况下，建议替换用于杂交的所有缓冲液。

食谱

TE缓冲区
10 mM Tris碱
1 mM EDTA
调整pH值至8.0
1x PBS
137mM NaCl
2.7 mM KCl
10mM Na 2 HPO 4 4/2 1.8mM KH 2 PO 4 4/2 调整pH值到7.4
在RT
存放
定影剂
10 ml 16％（v / v）EM级多聚甲醛
30毫升1x PBS
无菌过滤器，带0.22μm过滤器
在4°C储存
PBT

1％PBS中的0.1％Triton X-100 在RT
存放
1.5倍PAGE加载缓冲区 ¾在1x PBS中的8 M尿素
¼6倍凝胶加载染料
在RT
存放
10倍TBE
1 M Tris基地
1 M硼酸
20 mM EDTA
在RT
存放
15％PA - 8 M尿素储备（200毫升）
75 ml 40％（v / v）丙烯酰胺/双溶液
20毫升10倍TBE
96克尿素
使用dH 2 O
最高可达200毫升搅拌并加热（最高100°C）直至尿素完全溶解
在室温下储存，与光线隔离
20x SSC
3 M NaCl
300 mM柠檬酸钠
pH 7.0
在RT
存放
两次洗涤 - HYBEC
2x SSC
15％（v / v）碳酸亚乙酯
1 mM EDTA
0.1％Triton X-100
在RT
存放
2x全HYBEC
2x SSC
15％（v / v）碳酸亚乙酯
1 mM EDTA
50μg/ ml肝素
100μg/ ml鲑鱼精子ssDNA
0.1％Triton X-100
在RT
存放
80％TDE
80％（v / v）2,2'-硫代二乙醇（Sigma-Aldrich）
20％（v / v）1x PBS
充分混合并在RT
储存
裂解缓冲液
50 mM Tris-HCl pH 7.0
10 mM EDTA
1％（v / v）SDS
新鲜1毫米PMSF
新鲜的cOmplete™小型无EDTA蛋白酶抑制剂*
1：2,000新鲜RiboLock RNAse抑制剂
捕获杂交缓冲液
50 mM Tris-HCl pH 7.0
750 mM NaCl
1 mM EDTA
1％（v / v）SDS
15％（v / v）碳酸亚乙酯
新鲜1毫米PMSF
新鲜的cOmplete™ mini无EDTA蛋白酶抑制剂*
1：2,000新鲜RiboLock RNAse抑制剂
低盐洗涤缓冲液
2x SSC
0.5％（v / v）SDS
新鲜1毫米PMSF
新鲜的cOmplete™ mini无EDTA蛋白酶抑制剂*
高盐洗涤缓冲液
750 mM NaCl
30 mM柠檬酸钠pH 7.0
0.5％（v / v）SDS
新鲜1毫米PMSF
新鲜的cOmplete™ mini无EDTA蛋白酶抑制剂*
洗脱缓冲液
10 mM Tris-HCl pH 7.0
1 mM EDTA
在RT
存放

*注意：根据制造商的说明添加。

致谢

这项工作是由EMBL资助的。该协议改编自Gaspar 等人，2017b。作者声明不存在相互冲突的利益冲突。

参考

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